蛋白质含量的测定→Folin酚法
目的要求
学习Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法。
实验原理
Folin-酚试剂法zui早是由Lowry确定的测定蛋白质浓度的基本方法。以后在生物化学领域得到广泛的应用。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin-酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这个方法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时较长，要严格控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。凡干扰双缩脲反应的基团，如—CO—NH2，—CH2—NH2，CS—NH2以及Tris缓冲液、蔗糖、硫酸铵、疏基化合物均可干扰Folin-酚反应，而且对后者的影响还要大得多。此外，酚类、柠檬酸对此反应也有干扰作用。
Folin-酚试剂由甲试剂和乙试剂组成。甲试剂由碳酸钠，氢氧化钠，硫酸铜及酒石酸钾钠组成。蛋白质中的肽键在碱性条件下，与酒石酸钾钠铜盐溶液起作用，生成紫红色配位化合物。乙试剂是由鳞钼酸和麟钨酸、硫酸、溴等组成。此试剂在碱性条件下，易被蛋白质中*的酚基还原呈蓝色反应，其色泽深浅与蛋白质含量成正比。此法也适用于测定*和*的含量。
本法可测定范围是25～250ug蛋白质。
试剂和器材
- 试剂
（1）、Folin-酚试剂甲：
A·4%碳酸钠溶液；
B·0.2mol/L氢氧化钠溶液；
C·1%硫酸铜溶液；
D·2%酒石酸钾钠溶液。
临用前将a与b等体积配制碳酸钠-氢氧化钠溶液。c与d等体积配制成硫酸铜-酒石酸钾钠溶液，然后这两种试剂按50:1的比例配合，即成Folin-酚试剂甲。此试剂临用前配制，一天内有效。
（2）、Folin-酚试剂乙。称钨酸钠（Na2WO2·2H2O）100g钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）25g置2000mL磨口回流装置内，加蒸馏水700mL，85%磷酸50mL和浓硫酸100mL。充分混匀，使其溶解。小火加热，回流10h（烧瓶内加小玻璃珠数颗，以防溶液溢出），再加入硫酸锂（LiSO4）150g，蒸馏水50mL及液溴数滴。在通风橱中开口煮沸15min，以出去多余的溴。冷却后定容至1000mL，过滤即成Folin-酚试剂乙贮存液，此液应为鲜黄色，不带任何绿色。置棕色瓶中，可在冰箱长期保存。若此贮存液使用过久，颜色由黄变绿，可加几滴液溴，煮沸几分钟，恢复原色仍可继续使用。
试剂乙贮存液在使用前应确定其酸度。乙之滴定标准氢氧化钠溶液（1mol/L左右），以*为指示剂，当溶液颜色由红→紫红→紫灰→墨绿时即为滴定终点。该试剂的酸度应为2mol/L左右，将之稀释至相当于1mol/L酸度应用。
2、标准和待测蛋白质溶液
（1）、标准蛋白质溶液。结晶牛血清白蛋白或酪蛋白，预先经微量克氏定氮法测定蛋白质含量，根据其纯度配制成150ug/mL蛋白溶液。
（2）、待测蛋白质溶液。人血清，使用前稀释150倍。
3、器材
试管1.5cm×15cm（×6），试管架，移液管0.5mL（×2）；1mL（×2）；5mL（×1）；恒温水浴；分光光度计。
注意事项
(1)、Folin-酚乙试剂在酸性条件下较稳定，而Folin-酚甲试剂是在碱性条件下与蛋白质作用生成碱性的铜-蛋白质溶液。当Folin-酚乙试剂加入后，应迅速摇匀（加一管摇一管），使还原反应产生在麟钼酸-麟钨酸试剂被破坏之前。
（2）、血清稀释的倍数应使蛋白质含量在标准曲线范围之内，若超过此范围则需将血清酌情稀释。
