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PI染色实验代测

PI染色简介：

碘化丙啶( propidium iodide,PI )检测早期死亡细胞膜通透性状态的不同是区分细胞凋亡和坏死的一一个重要指标,凋亡细胞在进入最终溶解阶段前,细胞膜通透性无明显改变,相对分子质量大的与DNA结合的荧光染料(如PI )不能进入凋亡细胞内,而相对分子质量小的荧光染料(如Hoechest 3342或33258等)仍能被细胞摄取。应用流式细胞仪或荧光显微镜可区分和坏死细胞,细胞内DNA出现Hoechest 3342 标记而不出现PI标记的为凋亡细胞。

PI染色原理：

主要是根据细胞凋亡时在细胞、亚细胞和分子水平上所发生的特征性改变。这些改变包括细胞核的改变、细胞器的改变、细胞膜成分的改变和细胞形态的改变等，其中细胞核的改变具有特征性。

PI实验说明：

1、PI染色拍照使用的是荧光拍照。

实验步骤（仅供参考）：

1、收集细胞{数目约（1~ 5）×106个/mL}，500 ~ 1000 r/min离心5min，弃去培养液。

2、3ml　PBS洗涤1次。

3、离心去PBS，加入冰预冷的70%的乙醇固定，4℃，1—2小时。

4、离心弃去固定液，3mlPBS重悬5min。

5、400目的筛网过滤1次，500—1000r/min离心5min，弃去PBS

6、用1ml　PI染液染色，4℃避光30min。

7、流式细胞仪检测：PI用氩离子激发荧光，激光光波波长为488nm，发射光波波长大于630nm，产生红色荧光分析PI荧光强度的直方图也可分析前散射光对侧散射光的散点图。

8、结果判断：在前散射光对侧散射光的散点图或地形图上，凋亡细胞与正常细胞相比，前散射光降低，而侧散射光可高可低，与细胞的类型有关；在分析PI荧光的直方图时，先用门技术排除成双或聚集的细胞以及发微弱荧光的细胞碎片，在PI荧光的直方图上，凋亡细胞在G1/G0期前出现一亚二倍体峰。如以G1/G0期所在位置的荧光强度为1.0，则一个典型的凋亡细胞样本其亚二倍体峰的荧光强度为0.45，可用鸡和鲑鱼的红细胞的PI荧光强度做参照标准，两者分别为0.35和0.7，可以确保在两者之间的不是细胞碎片而是完整的细胞。

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