当前位置:上海康朗生物科技有限公司>>技术文章>>RLM-RACE法合成双链cDNA
1. 酶类及分子量标准
1) 高保真酶Easy-A high fidelity cloning enzyme,Merck公司Stratagene系列;
2) Taq DNA Polymerase,
3) DL 2000 DNA Marker,
2. 主要试剂(盒)
1) GeneRacerTM Kit,美国Invitrogen公司;
2) SuperScriptTM II Reverse Transcriptate,美国Invitrogen公司;
3) dNTP,
4) 其他试剂为国产分析纯。
1. MDF-192型超低温冰箱,日本三洋电机株式会社;
2. CF43S超净工作台,Gelman公司;
3. 高速冷冻台式离心机,Heraeus Sepatech公司;
4. Capsule HF-120型微量离心装置,Millipore公司;
5. BL150S型电子天平,德国Sartorius公司;
6. GB 1302型天平,Mettler-Toledo仪器(上海)有限公司
7. YXQ.WY21-600IIR卧式高压蒸汽消毒器,广州市医疗设备厂;
8. DYCD-31D型水平电泳槽,北京六一仪器厂;
9. EPS1001型电泳电源,Amersham Pharmacia公司;
10. 连续可调微量移液器,德国Eppendorf公司;
11. Primus 25型PCR基因扩增仪,德国MWG公司;
12. AlphaImager 2200型凝胶图像分析系统,Alpha Innotech公司;
13. XK96-B微型旋涡混合仪,江苏省姜堰市新康仪器厂。
无菌感染期线虫RNA
1. 总RNA双链cDNA的合成
按照GeneRacerTM Kit 说明书的方法RLM-RACE法合成双链cDNA 。
2. RNA脱磷酸
1) 脱磷酸反应
A. 在无菌的1.5 mL离心管中依次加入下列组分建立反应体系(冰上操作):
| Total RNA | 3.6 µL |
|
| 10×CIP Buffer | 1 µL |
|
| RNaseOutTM (40U/µL) | 1 µL |
|
| CIP (10U/µL) | 1 µL |
|
| DEPC water | 3.4 µL |
|
| Total Volume | 10 µL |
|
B. 轻混反应物,微漩涡,微离,50℃温育1 h,微离后置于冰上。
2) 沉淀RNA
A. 在上述反应液中加入90 μL DEPC H2O和100 μL酚/仿,漩涡混匀 30秒;
B. 室温18000 rpm高速离心5 min;
C. 小心吸取上层水相到一新的离心管内;
D. 加入2 μL(10 mg/mL)mussel glycogen ,10 μL 乙酸钠(3 M,pH 5.2),温和混匀,再加入220 μL 95%乙醇,微漩涡混匀;
E. 置于-80℃,10 min;或-20℃过夜;
F. 4℃条件下,18000 rpm离心20 min,获得沉淀的RNA;
G. 小心吸弃上清液,加入500 μL 70%乙醇,上下颠倒混匀,再微漩涡;
H. 4℃,18000 rpm离心2 min,吸弃上清,再离心几秒,用移液器*除去乙醇,风干;
I. 沉淀溶于8 μL DEPC H2O中,取1 μL进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。
3. mRNA脱帽
1) 脱帽反应
A. 在无菌的1.5 mL离心管中依次加入下列组分建立反应体系(冰上操作):
| 脱磷酸RNA | 7 µL |
|
| 10× TAP Buffer | 1 µL |
|
| RNaseOutTM (40U/µL) | 1 µL |
|
| TAP (40U/µL) | 1 µL |
|
| Total volume | 10 µL |
|
B. 轻混反应物,微漩涡,微离,37℃温育1 h,微离后置于冰上。
2) 沉淀RNA
方法同1中2)
4. 脱帽mRNA与RNA Oligo的连接
1) 连接反应
A. 加7 μL脱磷酸、脱帽的RNA至GeneRacerTM RNA Oligo中,用吸头混匀,微离收集液体;
B. 65℃温育5 min,冰上致冷,微离;
C. 在管中依次加入下述组分建立反应体系:
| 10× Ligase Buffer | 1 µL |
|
| 10 mM ATP | 1 µL |
|
| RNaseOutTM (40U/μL) | 1 µL |
|
| T4 RNA Ligase (5U/μL) | 1 µL |
|
| Total volume | 10 µL |
|
D. 37℃温育1 h,微离,冰上致冷。
2) 沉淀RNA
方法同1中2),zui后加11 μL DEPC H2O,取1 μL进行电泳检测。
5. 反转录*链cDNA
1) 依次加入下述组分于上述10 μL连接体系中:
| GeneRace Oligo dT Primer | 1 µL |
|
| dNTP Mix | 1 µL |
|
| RNaseOutTM (40U/μL) | 1 µL |
|
2) 65℃温育5 min,冰上致冷2 min,微离;
3) 依次加入下述组分于上述13 μL混合体系中:
| 5× First Strand Buffer | 4 µL |
|
| 0.1 M DTT | 1 µL |
|
| RNaseOutTM (40U/μL) | 1 µL |
|
| SuperScriptTM III RT (200U/μL) | 1 µL |
|
| Total volume | 20 µL |
|
4) 吸头混匀,微离,50℃温育1 h;
5) 70℃,15 min终止反应,冰上冷却2 min,微离心(室温,18000 rpm);
6) 混合反应物中加入1 μL的RNase H(2 U), 37℃温育20 min;
7) 微离,直接用于PCR扩增或-20℃贮存。
6. PCR扩增dscDNA
以反转录*链cDNA为模板,按以下组分,建立PCR反应体系:
ddH2O | 36.5 µL |
|
10×PCR buffer | 5 µL |
|
dNTP Mix (10 mmol/L) | 1 µL |
|
GeneRacerTM 3’ Primer (10 µmol/L) | 3 µL |
|
GeneRacerTM 5’ Primer (10 µmol/L) | 3 µL |
|
RT template | 1 µL |
|
Easy-A high fidelity cloning enzyme | 0.5 µL |
|
Total volume | 50 µL |
|
充分混匀,按以下程序进行PCR扩增:95℃热变性2 min,迅速加入高保真酶,再94℃变性2 min进入循环,94℃变性30 秒,65℃退火30秒,68℃延伸2 min,25个循环后于68℃继续延伸10 min。扩增产物以琼脂糖凝胶电泳检测,置于-20℃保存备用。
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