兔子组织型纤溶酶原激活剂（t-PA）ELISA试剂盒标本要求

1. 血清：：温血液自然凝固10-20分钟后，离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

2. 血浆：根据标本的要求选择EDTA、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

3. 尿液：无菌管收集。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照此实行。

4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。

5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS(PH7.4)，或组织蛋白萃取试剂，用手工或匀浆器将标本匀浆化。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。

兔子组织型纤溶酶原激活剂（t-PA）ELISA试剂盒使用方法

测定法的灵敏度来自作为报告的酶。*，酶是一种有机催化剂，很少量的酶即可诱导大量的催化反应，产生可供观察的显色反应现象。因此该体系常被称为酶放大体系。

1. 标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。

   24μg/ml    5号标准品    150μl的原倍标准品加入150μl标准品稀释液

   12μg/ml    4号标准品    150μl的5号标准品加入150μl标准品稀释液

   6μg/ml     3号标准品    150μl的4号标准品加入150μl标准品稀释液

   3μg/ml     2号标准品    150μl的3号标准品加入150μl标准品稀释液

   1.5μg/ml   1号标准品    150μl的2号标准品加入150μl标准品稀释液

2. 加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品zui终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3. 温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。   

4. 配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用

5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

6. 加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。 

7. 温育：操作同3。

8. 洗涤：操作同5。

9. 显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.

10. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

11. 测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。

注意事项

    1. 由于底物显色剂对光及其敏感，因此要避光保存。

2. 检测吸光度前应将酶标仪打开，将其预热30min以上。

3. 孵育的时间应该严格按照试剂盒说明书上的时间为准。

4. 要尽量做双孔实验，这样才既能保证数据的准确性，又能反映出试剂盒的精密度。

5. 对样本的结果有疑问时需要使用其他检测方法进行验证。

实验规则：
1、要保证移液枪的准确性，误差不能超过2%。可用水和电子天平进行确定。但有专业人员进行矫正。
2、要配备20ul、50ul、100ul、1000ul和排枪各一支。吸取不同的液体后，要更换枪头。即使是吸取标准品时。
3、要在实验前1小时将试剂盒从冰箱中取出，使各种试剂都恢复到室温，以使结果更稳定。
4、实验时，要使底物避光保存。
5、用枪吸取液体时速度不能太快，以免产生气泡而使吸取量不准确。
6、吸取液体时，要用量程和需要量接近的枪去吸，减少误差。
7、将液体加到酶标孔中时，避免枪头和孔内液体接触，可使枪头上的液滴和孔壁接触，液滴会自然流下去。
8、液体全部加完后，可将酶标板在桌子上平行轻轻晃动30秒，混匀液体。也可以用酶标仪的晃动功能。
9、应尽量做双孔实验，这样才能保证数据的准确性。
10、对结果有疑问的样品要用其它方法进行确证。