污水处理设备 污泥处理设备 水处理过滤器 软化水设备/除盐设备 纯净水设备 消毒设备|加药设备 供水/储水/集水/排水/辅助 水处理膜 过滤器滤芯 水处理滤料 水处理剂 水处理填料
上海酶联生物研究所
上海酶联生物研究所
阅读：498发布时间：2012-9-11
以抗体技术为基础的免疫检测应用和相关的疾病治疗领域如癌症，自发免疫紊乱等一直推动着抗体筛选研究的发展。单克隆抗体是会由特定的细胞系分泌到上清液中，而对上清液的筛选则成为了药物研发的核心领域。
均相结合实验
尽管ELISA和流式细胞仪等传统手段被广泛应用，但是这两种检测手段都存在很多的局限性，特别是对细胞表面低丰度抗原的检测。同时，这两种平台需要很繁琐的洗板和孵育的步骤而且耗费大量细胞和时间才能获取数据。为了解决这些技术瓶颈，我们开发了mirrorball这个高灵敏度检测平台和“即混即读”的实验方案，这样就大幅度的提高了抗体筛选的通量并且避免了繁琐的实验步骤。您所需要进行的实验仅仅是将所有的反应物一次性的加入到孔中并孵育一段时间。这里待检测的可以是结合在微球上的可溶性抗原也可以是细胞表面表达的抗原，一旦反应达到平衡状态，那么结合了一抗的珠子和细胞可以很快的通过荧光标记的二抗来检测到。由于mirrorball的这种高灵敏度特性，使得我们可以比流式和传统ELISA更早的检测样品，并且只需要5ul左右的待测样品。均相反应体系可以大幅度的减少试剂的消耗，特别适用于研究昂贵和低丰度的抗原。mirrorball的数据扫描和获取
微孔板进行扫描时使用488nm和640nm的激发光。使用TTP LabTech公司的阈值算法和两种形态荧光参数，每孔中的细胞都会 “on-the-fly”。。而使用mirrorball的图像Cellista™软件，我们可以进行全景扫描，得到数据可视化中的各种数据图形（包括直方图或散点图，3D荧光强度分布图）和整个微孔的图片。
ABI 8200的数据扫描和获取
使用640 nm激光扫描样品，进行细胞计数和荧光总强度检测，数据导出到Excel文件和处理。实验数据仅仅收集了孔中心1 mm2面积区域。
数据结果
为了比较mirrorball和ABI 8200在EGFR检测灵敏度方面的差异性，将A431细胞与梯度稀释的EGFR一抗以及AlexaFluor647标记的goat anti-mouse IgG二抗共同孵育。 在用mirrorball分析时，用CFSE对细胞进行染色，预先定位细胞并进行计数，细胞量为384孔板每孔2000个。对于ABI的8200， A431细胞量为每孔8000个接种。
均相抗体结合实验的分析
mirrorball和ABI 8200 FMAT 都在设计上融入了很多适用于均相结合实验的特性。通过使用激光作为激发光源和光电倍增管作为检测装置，这使得它们能够检测到低亲和力的抗体和低丰度的抗原的结合。两个系统都在光路设计上zui大程度的降低了背景荧光并在扫描读数的时候大幅度的提高了信噪比。在这个应用介绍里我们特别的比较了两个平台 mirrorball和ABI 8200 在通过细胞水平实验进行抗体筛选时的性能优异性。通过对比，我们展示了mirrorball的多重荧光检测能力，这使多重抗原标记并同时检测成为了可能。
方法
细胞系和培养方法
在这项研究中，比较了mirrorball和ABI8200系统在进行A431细胞EGFR抗体结合实验时的。 A431细胞在EMEM培养（EBSS）（Sigma公司）含10%胎牛血清，2mM*（Sigma公司），1X非必需氨基酸（NEAA）（Sigma）和100 U / mL*以及100 U / ml*。 A431细胞培养至80%汇合度时用0.25%*和EDTA收集，洗净悬浮在培养基中。除非另有说明，培养试剂均购自Life Technology。
抗体和试剂
检测抗体，鼠抗人表皮生长因子抗体（抗EGFR抗体），购自Merck Chmicals Ltd（#GR01）。山羊抗鼠IgG，AlexaFluor647 （#A21235）由Life Technologies公司提供。
CFSE标记
5（6） - 羧基二乙酸N -琥珀酰亚胺酯（CFSE）（Sigma公司）配置为100mM在DMSO溶液里。 CFSE（10nM）被添加到细胞里并在室温中孵育10分钟。用4%FBS的PBS（2ml）终止反应。进一步孵化，于37° C下10分钟后，细胞1000 x g离心5分钟。
EGFR实验
抗EGFR抗体在培养基中梯度稀释，并添加20ul到384孔板中（Costar#3712）。对于mirrorball系统，暂停用CFSE标记A431细胞含有1 ×105个细胞/ mL和6nM抗鼠IgG AlexaFluor647二抗。对于ABI的8200平台，准备A431细胞的悬浮液包含4× 105细胞/ mL和6nM抗鼠IgG AlexaFluor647。首先，加入在各孔中加入20uL混合有荧光二抗的细胞悬液在37℃，孵育2小时。分别在mirrorball和ABI8200平台上进行扫描并测定结合有EGFR抗体的细胞数量。zui后，mirrorball和ABI8200的浓度分别为2000细胞/孔和8000
商铺：https://www.hbzhan.com/st32881/
主营产品：ELISA试剂盒，人ELISA试剂盒，小鼠ELISA试剂盒，豚鼠ELISA试剂盒，兔ELISA试剂盒，羊ELISA试剂盒，牛ELISA试剂盒，鸡ELISA试剂盒，鸭ELISA试剂盒，植物ELISA试剂盒
环保在线 设计制作，未经允许翻录必究 .
请输入账号
请输入密码
请输验证码
请输入你感兴趣的产品
请简单描述您的需求
请选择省份