植物P型ATP酶活性酶连续反应光度法定量检测试剂盒就说明书

主要用途

植物P型ATP酶（P type ATPase）活性酶连续反应光度法定量检测试剂是一种旨在使用P型ATP酶、丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶连续循环法反应系统，在钒酸盐存在与否的情况下，受到P型 ATP酶的水解产生的ADP过程中，伴随的还原型腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反应，即采用光度法测定其氧化后吸光峰值（NADH浓度）的变化，以此进行测算样品中酶活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适合于各种植物组织，包括种子（seed）、叶片（leaf）、根（root）、胚胎叶（cotyledon）、上胚轴（epicotyl）等P型ATP酶的特异性活性检测。产品不含污染性蛋白酶，严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，反应优化，检测敏感。

技术背景

腺苷三磷酸酶，又称为ATP酶（adenosine triphosphatase；ATPase或ATP phosphohydrolase；EC3.6.1.3），属于磷酸水解酶，可以催化含磷的酸酐分解，即催化三磷酸腺苷分解为二磷酸腺苷和无机磷。ATP酶的去磷酸化反应释放出能量，成为细胞生命代谢的能源。ATP酶为跨膜蛋白（transmembrane），帮助传输各种代谢分子进出细胞。根据ATP酶的结构和功能，分为五类不同的ATP酶，即F、V、A、P和E型。P型ATP酶，又称为E1-E2 ATP酶，通常由一条或两条多肽构成，且呈现两种主要的结构构象E1和E2。这类ATP酶存在于细菌和真核细胞膜和细胞器上，其功能在于水解ATP获得能量，跨膜运输各种化学分子，包括离子和磷脂，例如H⁺、Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Ag⁺、Zn²⁺、Co²⁺、Pb²⁺、Ni²⁺、Cd²⁺、Cu²⁺等。P型ATP酶可以分成4种，Ca²⁺传输性、Na⁺-K⁺ /H⁺-K⁺传输性、H⁺传输性和所有细菌型等。 基于ATP，在P型ATP酶抑制剂钒酸盐（vanadate） 存在与否的情况下，受到P型ATP酶的水解，进而通过丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase；LDH）反应系统中，还原型腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）转化为氧化型腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其峰值的变化（340nm），来定量分析P型ATP酶的特异活性。其反应系统为：

P type ATPase

 ATP  +  H2O  →    ADP  +  Pi

Vanadate

pyruvate kinase

Phosphoenolpyruvate  +  ADP       →      pyruvate +  ATP

lactate dehydrogenase

pyruvate +  NADH       →      lactate  +  NAD⁺

    （高吸收峰）    （低吸收峰）

产品内容

清理液（Reagent A）         60毫升

裂解液（Reagent B）             20毫升

缓冲液（Reagent C）         20毫升

酶促液（Reagent D）            500微升

反应液A（Reagent E1）            1.2毫升

反应液B（Reagent E2）            1.2毫升

底物液（Reagent F）          2.5毫升

阴性液（Reagent G）            1毫升

专性液（Reagent H）           1.2毫升

产品说明书                1份

保存方式

保存清理液（Reagent A）和反应液B（Reagent E2）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里，避免反复冻融；底物液（Reagent F），避免光照，有效保证6月

用户自备

15毫升锥形离心管：用于样品制备的容器

1.5毫升离心管：用于样品制备和保存的容器

DOUNCE匀浆器：用于组织匀化

微型台式离心机：用于样品制备

培养箱：用于反应孵育

比色皿：用于光度分析的容器

分光光度仪：用于光度分析

实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液置入冰槽里融化；底物液（Reagent F）注意避光。然后进行下列操作。

一、 样品准备（总蛋白制备）

1． 准备好新鲜的植物组织（叶片、谷粒、种子等），并秤重以确定组织重量 

2． （选择步骤）放进预冷的15毫升锥形离心管

3． （选择步骤）加入适量的（1克组织需要3毫升）清理液（Reagent A）清洗1次

4． 即刻用刀片切碎组织

5． 放进一个预冷的15毫升锥形离心管

6． 加入预冷的1毫升裂解液（Reagent B）

7． 涡旋震荡5秒，充分混匀

8． 即刻放进预冷的DOUNCE匀浆器，在冰槽里用匀浆棒匀化组织（约80下）

9． 将所有组织匀浆物移入1.5毫升离心管，放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）

10． 小心移出上清液（注意：不要触碰沉淀物）到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管

11． （选择步骤）如果上清液含有肉眼可见的残渣，重复离心5分钟一次，速度为5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）

12． 即刻移入到1.5毫升离心管

13． 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）

14． 放进－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里备用

二、测定准备

1． 准备好待测样品，置于冰槽里 

2． 设定好分光光度仪（温度为28℃）：波长为340nm，间隔5分钟，读数7次（共30分钟），并置零

3． 缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度

三、 背景对照测定

1． 移取630微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入20微升酶促液（Reagent D）

3． 加入100微升反应液A（Reagent E1）

4． 加入100微升反应液B（Reagent E2）

5． 加入100微升底物液（Reagent F）

6． 放进28℃培养箱里静置3分钟

7． 加入50微升阴性液（Reagent G）

8． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）

9． 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照：340波长读数0分钟 －340波长读数30分钟

四、样品总活性测定

1． 移取630微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入20微升酶促液（Reagent D）

3． 加入100微升反应液A（Reagent E1）

4． 加入100微升反应液B（Reagent E2）

5． 加入100微升底物液（Reagent F）

6． 放进28℃培养箱里静置3分钟

7． 加入50微升待测样品（注意：100微克总蛋白；样品须溶解）

8． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）

9． 即刻放进分光光度仪检测，此为样品总活性读数：340波长读数0分钟 －340波长读数30分钟

五、样品非特异活性测定

1. 移取730微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿

2. 加入20微升酶促液（Reagent D）

3. 加入100微升专性液（Reagent H）

4. 加入100微升底物液（Reagent F）

5. 放进28℃培养箱里静置3分钟

6. 加入50微升待测样品（注意：100微克总蛋白；样品须溶解）

7. 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）

8. 即刻放进分光光度仪检测，此为样品非特异活性读数：340波长读数0分钟 －340波长读数30分钟

六、 计算样品活性

1）样品活性（总活性和非特异活性）

[（样品读数－背景读数）X 1（体系容量；毫升）X样品稀释倍数]÷[0.05（样品容量；毫升）X 6.22（毫摩尔吸光系数）X 10或30（反应时间；分钟）]＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克

或者

[（样品读数－背景读数）X 1（体系容量；毫升）X样品稀释倍数]÷[0.05（样品重量；毫克）X 6.22（毫摩尔吸光系数）X 10或 30（反应时间；分钟）]＝单位/毫克 

单位＝微摩尔NADH/分钟

2）样品特异活性

样品总活性－样品非特异活性＝样品特异活性

注意事项

1． 本产品为21次操作（10个样本），包括背景对照测定

2． 操作时，须戴手套

3． 系统操作过程中，背景测定只需1次

4． 建议使用质膜样品为佳（植物组织质膜（plasma membrane）分离试剂盒—16022）

5． 建议样品忌用磷酸缓冲溶液、EDTA、EGTA等，可以使用SUCROSE、IMIDAZOLE等

6． 加入样品启动反应后3秒内即刻光度测定

7． 反应测定值由高到低变化；测定可以持续30分钟

8． 测定值由高到低变化，即0分钟测定读数高于10分钟或30分钟测定读数，表明有酶活性

9． 光度测定后，比色皿须清洗

10． 建议待测样本蛋白浓度为100微克/50微升；如果样本酶活性过低或过高，则可以增加或降低样本量；注意计算公式的调整（本公司提供 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒30030.1）

11． 样品特异活性是指钒酸盐敏感的P型ATP酶

12． P型ATP酶活性单位浓度定义：在28℃温度下，pH 7.5条件下，每分钟内能够氧化1微摩尔还原型腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作为一个活性单位

13． 本公司提供系列ATP酶类分析技术产品

质量标准

1． 本产品经鉴定性能稳定

2． 本产品经鉴定检测准确