细菌糖类总量硫酸-比色法定量检测试剂盒产品说明书

主要用途

细菌糖类总量硫酸-比色法定量检测试剂是一种旨在通过硫酸处理后，水解产生单糖，与反应，生成黄色产物，即采用比色法测算糖类总量的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适合于各种细菌细胞样品中糖类总量的检测。产品即到即用，操作简捷，性能稳定，检测敏感。

技术背景

糖类（saccharide），又称为碳水化合物（carbohydrate），其分成四类：单糖（monosaccharide；例如葡萄糖）、二糖（disaccharide；例如蔗糖）、寡糖（oligosaccharide；棉籽糖）和多糖（polysaccharide；例如淀粉和糖原）。糖类构成辅酶和核酸，以及细胞结构的重要元素，在能量储存、免疫功能、授精、预防病理变化、血液凝结、发育等方面具有重要作用。使用浓硫酸，将复杂性多糖水解成单糖，脱水产生反应性中间产物，与反应，生成黄色产物，在分光光度仪（492nm 波长）下出现吸光峰值的变化，来定量测定样品中糖类量的总含量。 

产品内容

稀释液（Reagent A）          5毫升

反应液（Reagent B）         5毫升

酸性液（Reagent C）         25毫升

标准液（Reagent D）         500微升

裂解液（Reagent E）         10毫升

产品说明书               1份

保存方式

保存在4℃冰箱里；酸性液（Reagent C）具有腐蚀性，注意操作安全；反应液（Reagent B）避免光照；有效保证6月

用户自备

1.5毫升离心管：用于标准样品配制和反应的容器

干式恒温仪或恒温水槽：用于反应孵育

超声仪：用于裂解细菌细胞

比色皿：用于比色的容器

分光光度仪：用于比色分析 

实验步骤

一、样品准备 

1．准备好10毫升待测的细菌放进37℃摇床孵育16小时，速度为220RPM

2．直至OD600＝0.4至0.8，即1至2 X 107细胞/毫升

3．置于冰槽里5分钟

4．放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为1000g

5．小心抽去上清液

6．加入500微升裂解液（Reagent E），充分混匀

7．转移到预冷的1.5毫升离心管

8．强力涡旋震荡15秒

9．置于超声仪下：200瓦，50%功率，10秒一次，重复3次

10．冰槽里静置15分钟

11．放进4℃微型台式离心机离心15分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

12．小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管

13．移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）

14．即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

二、标准样品配制

1．准备好5个1.5毫升离心管，标记为1至5号管

2．分别加入200微升稀释液（Reagent A）到每个离心管

3．移取200微升标准液（Reagent D）到1号管，混匀

4．小心移取200微升1号管稀释的标准液（Reagent D）到2号管，混匀

5．小心移取200微升2号管稀释的标准液（Reagent D）到3号管，混匀

6．小心移取200微升3号管稀释的标准液（Reagent D）到4号管，混匀

7．将1至5号管放进冰槽里备用，避免光照；标准管浓度见下表

三、样品测定

1．设定好分光光度仪：波长492nm，并置零

2．分别移取200微升反应液（Reagent B）到1.5毫升离心管

3．分别加入200微升上述制备的标准样品或待测样品，混匀

4．分别加入1毫升酸性液（Reagent C），混匀

5．在80℃干式恒温仪孵育30分钟（注意：如果复杂多糖无法充分水解，建议使用煮沸5至30分钟处理）

6．室温下冷却10分钟，避免光照

7．转移到新的比色皿

8．即刻放进分光光度仪检测（492nm波长）：获得吸光读数

9．构建标准曲线：纵座标（Y轴）为吸光读数；横座标（X轴）为标准麦芽糖含量（微克）

10．根据标准曲线获得样品对应麦芽糖含量（微克）

11．计算样品实际麦芽糖浓度（微克/毫升） 

【根据标准曲线获得样品对应麦芽糖含量（微克）÷0.2（样品容量：毫升）】×10（样品稀释倍数）=微克/毫升

注意事项

1．本产品为25次操作，包括标准液

2．本产品适用于还原性、非还原性糖类、寡糖以及复杂性糖类，但不适合于氨基糖或脱氧糖及其衍生物

3．本产品检测范围为0.2至50微克糖类总量

4．本产品适用于96孔板操作，实际用量按比例减少

5．操作时，须戴手套

6．酸性液（Reagent C）具有腐蚀性，注意操作安全

7．孵育时，避免光照

8．如果待测样品浓度过高或过低，可以稀释样品用量；注意在计算实际浓度时，不要忘记稀释倍数调整

9．糖类总量表述方式：微克麦芽糖/毫升；微克麦芽糖/细胞量；微克麦芽糖/总蛋白量

10．本公司提供系列糖类检测试剂产品

质量标准

1.本产品经鉴定性能稳定

2.本产品经鉴定检测敏感