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HL50264.2 v.A
组织3-羟-3-甲戊二酰(HMG-COA)合成酶活性光度法定量检测试剂盒产品说明书
主要用途
组织3-羟-3-甲戊二酰(HMG-COA)合成酶活性光度法定量检测试剂是一种旨在运用乙酰和乙酰乙酰,在HMG-COA合成酶的催化下,使烯醇式乙酰乙酰减少致吸光峰值的降低,即采用光度法来测定组织裂解样品中酶活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种组织裂解悬液、微粒体,或纯化酶样品3-羟-3-甲戊二酰(HMG-COA)合成酶的活性检测,以及抑制剂筛选。产品严格无菌,即到即用,操作简捷,性能稳定。
技术背景
3-羟-3-甲戊二酰合成酶(3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA synthase;HMGS;EC2.3.3.10)属于酰基缩合酶(acyl condensing enzyme)家属中的成员之一,是通路和甲戊二羟酸通路的重要的限速酶之一,调节、类异戊二烯脂以及酮体分子的产生,受到固醇和非固醇分子的反馈抑制。HMG-COA合成酶存在于各种动物、昆虫、植物、真菌,以及某些细菌中。通过催化乙酰和乙酰乙酰的生物克莱森缩合反应(Claisen Condensation),生成3-羟-3-甲戊二酰(3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA;HMG)。动物HMG-COA合成酶分成两种亚型:线粒体型和胞浆型。线粒体型占主要,与酮体生成相关,而胞浆型与和类异戊二烯脂生物合成相关。细菌HMG-COA合成酶与细胞壁合成、电子传递等有关,例如十一癸烯醇(undecaprenol)、甲萘醌(Menaquinone)和泛醌(ubiquinone)等分子合成。HMG-COA合成酶异常,会导致糖尿病酮症酸中毒(diabetic ketoacidosis;DKA)。 基于底物乙酰和乙酰乙酰,在HMG-COA合成酶的催化下,缩合产生3-羟-3-甲戊二酰(HMG-COA),其烯醇式(enol form)乙酰乙酰的减少,通过吸光峰值的降低变化(303nm 波长),来定量分析3-羟-3-甲戊二酰(HMG-COA)合成酶的活性。3-羟-3-甲戊二酰(HMG-COA)合成酶反应系统为:
产品内容
清理液(Reagent A) 毫升
裂解液(Reagent B) 毫升
缓冲液(Reagent C) 毫升
反应液(Reagent D) 微升
阴性液(Reagent E) 微升
产品说明书 1份
保存方式
保存裂解液(Reagent B)、缓冲液(Reagent C)、反应液(Reagent D)和底物液(Reagent E)在-20℃冰箱里;其余的保存在4℃冰箱里;反应液(Reagent D)和底物液(Reagent E)避免光照;有效保证6月
用户自备
1.5毫升离心管:用于样品保存的容器
15毫升锥形离心管:用于样品制备的容器
(微型)台式离心机:用于样品制备
200微升1厘米光径比色皿或96孔板:用于光度分析的容器
分光光度仪或酶标仪:用于光度分析
实验步骤
一、 样品准备
1. 手术取出动物组织,并秤重500毫克
2. (选择步骤)放进预冷的15毫升锥形离心管
3. (选择步骤)加入xx毫升清理液(Reagent A)清洗
4. (选择步骤)抽去清理液
5. 移入到一个液氮冻存管
6. 即刻放进液氮罐过夜
7. 次日从液氮罐里取出,即刻(最快速度)用研磨棒碾碎组织成粉末状(注意:切莫使组织冻融)
8. 放进一个15毫升锥形离心管
9. 加入置于冰槽里的xx微升裂解液(Reagent B)
10. 强力涡旋震荡30秒,充分混匀
11. 放进冰槽里孵育30分钟,期间每10分钟强力涡旋震荡30秒(注意:如需暂时停止,放进-70℃冰箱里储存备用)
12. 即刻放进4℃台式离心机离心10分钟,速度为10000g
13. 小心移取上清液到新的无菌的1.5毫升离心管
14. 移取10微升进行蛋白定量检测(注意:建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒-HL30030.1)
15. 放进-70℃的冰箱里保存或置于冰槽里备用
二、 测定准备
1. 开启并设定好分光光度仪(温度为30℃):波长303nm,间隔5分钟,读数2次(共10分钟),并置零
2. 从-20℃冰箱里取出试剂,置于冰槽里融化
3. 缓冲液(Reagent C)室温下均衡温度
三、 背景对照测定
1. 移取xx微升缓冲液(Reagent C)到新的比色皿
2. 加入xx微升反应液(Reagent D)
3. 上下倾倒数次,混匀
4. 在30℃温度下孵育3分钟
5. 加入xx微升阴性液(Reagent E)
6. 上下倾倒数次,混匀(限定在3秒之内)
7. 即刻放进分光光度仪检测,此为背景空对照(0分钟读数-10分钟读数)
四、 样品测定
1. 移取xx微升缓冲液(Reagent C)到新的比色皿
2. 加入xx微升反应液(Reagent D)
3. 上下倾倒数次,混匀
4. 在30℃温度下孵育3分钟
5. 加入20微升待测样品(200微克蛋白)(注意:样品须清澈)
6. 上下倾倒数次,混匀(限定在3秒之内)
7. 即刻放进分光光度仪检测,此为样品读数(0分钟读数-10分钟读数)
五、计算样品活性
六、 酶标仪测定
1. 在96孔板上做好相应标记:背景对照和样品
2. 分别移取xx微升缓冲液(Reagent C)到96孔板里
3. 分别加入xx微升反应液(Reagent D)
4. 轻轻摇动96孔板
5. 在30℃温度下孵育3分钟
6. 分别加入xx微升阴性液(Reagent E)或待测样品(200微克蛋白)到相应孔里(注意:样品须清澈)
7. 轻轻摇动96孔板
8. 即刻放进酶标仪检测:0分钟读数和10分钟读数
9. 活性计算:
注意事项
1. 本产品为20次操作,包括背景对照
2. 操作时,须戴手套
3. 系统操作过程中,背景测定只需1次
4. 建议使用比色皿测定
5. 样品须澄清,至关重要
6. 加样后3秒内光度测定
7. 测定值由高到低变化;测定持续10分钟
8. 光度测定后,比色皿须清洗
9. 样本测定0分钟读数高于10分钟读数表明具有酶活性
10. 建议待测样本蛋白浓度为200微克/20微升(本公司提供 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒-HL30030.1)
11. 如果待测样品浓度过高或过低,可以调整样品浓度
12. 3-羟-3-甲戊二酰(HMG-COA)合成酶单位活性定义为:在30℃,pH 7.8条件下,每分钟内缩合产生3-羟-3-甲戊二酰(HMG)所需的酶量作为一个活性单位
13. 本公司提供系列甲戊二羟酸(MEVALONATE)通路分析试剂产品
质量标准
1. 本产品经鉴定性能稳定
2. 本产品经鉴定检测敏感
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