PCR扩增产物的鉴定
实验原理
生物大分子如蛋白质、核酸、多糖等常以颗粒分散在溶液中．它们的净电荷取决于介质的H 浓度或与其他大分子的相互作用。在电场中，带电颗粒向阴极或阳极迁移．迁移的方向取决于它们带电的符号．这种迁移现象即谓电泳。迁移的方式目前可以根据分子尺寸大小、分子所带的电荷或分子的生物学与化学特性分为三类。如果把生物大分子的胶体溶液放在一个没有干扰的电场中，使颗粒具有一定迁移速率的驱动力来自于颗粒的有效电荷Q和电位梯度E。它们与介质的摩擦阻力f抗衡：在自由溶液中，这种抗衡服从斯托克斯定律。f=6πrvη 这里v是在介质粘度为η半径为r的颗粒的移动速度。但在凝胶中，这种抗衡并不*符合斯托克斯定律。f还取决于介质小的其他因子，如凝胶厚度、颗粒尺寸、甚至介质的内渗率等。简言之电泳就是带电颗粒在电场中定向移动。
银染显色的原理是用甲醛将沉积在DNA带上的银离子（*）还原成金属银而显带。
实验试剂
1. 聚丙烯酰胺（C=30% T=5%）：丙烯酰胺 28.5g 、 N，N’-二甲基双丙烯酰胺 1.5g、DDH2O 100ml；
2. 7％聚丙烯酰胺：30％聚丙烯酰胺 23.3ml、10ml 10×TBE溶液、66.7ml DDH2O；
3. 10×TBE溶液：Tris 113g 、硼酸 55g、 1000ml DDH2O；
4. 1×TBE溶液：10×TBE溶液100ml，900ml DDH2O；
5. 10%乙醇；
6. 0.1%硝酸；
7. 0.2%AgNO3：
8. AgNO3 0.15g、DH2O 225ml；
9. 30%NaCO3-甲醛：NaCO3 30g、甲醛 0.85ml；
10. 0.1% AgNO3：AgNO3 1g、1000ml DH2O；
11. 上样缓冲液：0.25％二甲苯氰蓝、0.25％溴酚蓝；
12. TEMED；
13. 10％过硫酸胺：过硫酸胺1g、10ml DDH2O。
实验设备
1. 垂直电泳仪
2. 垂直电泳槽
3. 玻璃
4. 橡胶模框
5. 点样梳
6. 摇床
7. 微量进样器
8. 染色托盘
实验材料
PCR扩增产物
实验步骤
1. 电泳槽玻璃板的处理：用洗涤剂清洗玻璃板，自来水反复冲净洗涤剂，双蒸水冲洗3次，烘干，将两块玻璃装入恰当德橡胶模框内，并组装好电泳槽（带长玻璃的贮液槽为正极，带短玻璃的贮液槽为阴极）。
2. 制胶：加 35μl TEMED和300μl2.5％过硫酸胺至7％聚丙烯酰胺溶液中混匀。以60O角，缓慢注入两玻璃板间的空隙中，直至灌满模具顶部。立即插入相应的点样梳，（小心勿使梳齿下带进气泡，并且不要将梳齿全部插入胶内，留约2mm梳齿于玻璃板上端，以免拔梳时把胶孔拔断）。由于凝胶在聚合过程中有回缩，所以应小心添加些胶液于梳子处，水平放置，室温聚合1小时。向电泳槽内灌入 1×TBE电泳缓冲液。小心取出点样梳，用槽内的缓冲液反复冲洗点样孔，以去除可能存在的未聚合的聚丙烯酸胺和气泡。
3. 加样：取2-4μl扩增产物和2μl上样缓冲液混匀,用微量进样器小心加入样品槽中。若DNA含量偏低,则可适当增加上样量,但总体积不可超过样品槽容量。
4. 电泳：电泳槽接上电极开启电源，根据扩增片段的大小及电泳槽和凝胶的大小，决定电泳的电压及电泳时间。通常室温下以l～5V／cm电泳。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时,停止电泳。
5. 银染法显色：
1) 方法一：
a. 将PAG板浸入10%乙醇溶液固定10min，用纯水洗一次；
b. 0.1%硝酸3min，蒸馏水洗两次。
c. 0.2% AgNO3溶液中10min，用去离子水洗三次；
d. 用30% NaCO3-*显色至满意为止，用适量10%冰乙酸终止显色。
2) 方法二：
a. 取下凝胶，蒸馏水清洗凝胶30秒；
b. 0.1% *染色10分钟；
c. 弃去染色液，蒸馏水洗胶两次；
d. 显色液（显色液配方：10g NaOH 0.2g Na2CO3 2ml*，定溶到 500ml）显色至满意为止。
6. 分型：参照基因阶梯的电泳谱带进行分型。
注意事项
1. 每加完一个样品要清洗微量进样器,以防止互相污染,注意上样时要小心操作,避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。
2. 以二甲苯氰蓝和溴酚蓝的位置大致判断泳动距离，7％聚丙烯酰胺非变性胶中溴酚蓝相当于170bp的泳动距离，二甲苯氰蓝相当于40bp的泳动距离。
3. 银染时显色液配制好在4-10 ℃预冷可以减轻胶板的底色，银染后胶板在水中漂洗时间控制在10s以内。
