中文说明书                                                UNIONHONEST

本品仅供研究使用                酶联免疫吸附测试  Enzyme linked lmmunosorbent Assay

                     昆虫蜕皮激素(Ecdysone)ELISA检测试剂盒

用    途： 用于昆虫血清、血浆及相关液体样本中蜕皮激素(Ecdysone)的测定。

检测原理

本试剂盒采用的是*双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）测定样品中昆虫蜕皮激素(Ecdysone)的水平。向预先包被了昆虫蜕皮激素(Ecdysone)单克隆抗体的酶标孔中加入蜕皮激素(Ecdysone)，温育；温育后，加入*标记的抗蜕皮激素(Ecdysone) 抗体，再与链霉亲和素-HRP结合，形成免疫复合物，再经过温育和洗涤，去除未结合的酶，然后加入底物A、B，产生蓝色，并在酸的作用下转化成终的黄色。颜色的深浅与样品中昆虫蜕皮激素(Ecdysone)的浓度呈正相关。

试剂盒组成

需要而未提供的试剂和器材

1. 酶标仪(450nm检测波长滤光片，570nm或630nm校正波长滤光片) 。
2. 洗板机（可调注液量，保证每孔洗液加至0.35ml而不溢出）。
3. 超净工作台，生物安全柜，通风柜。
4. 高精度单道加液器（量程为0.5-10μl, 2-20μl,20-200μl,200-1000μl).
5. 高精度多道加液器（8道或12道，量程为50-300μl).
6. 37℃恒温箱。
7. 低温离心机。
8. 电冰箱（4℃,-20℃,-86℃）.

9.  漩涡混合仪，低频振荡器等

注意事项

1. 从2-8℃取出的试剂盒，在开启试剂盒之前要室温平衡至少30分钟。酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。
2. 严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准。
3. 为避免交叉污染，要避免重复使用手中的吸头和封板膜。
4. 不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。
5. 底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。

6.   所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按生物废弃物处理。终止液为2M硫酸，使用时必须注意安全。

7.  各步骤加样均应使用加样器，并经常校准其准确性，以避免试验误差。一次加样时间控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。

8.  每次试验测定的同时做标准曲线，。如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔浓度的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请后乘以总稀释倍数（×n）。

9.  配制试剂时，要用旋涡混合仪混匀。加入孔内的试剂，充分混匀对测试结果尤为重要，使用微量振荡器(使用低频率)，如无微量振荡器，可在反应前手工轻轻晃动酶标板1分钟，例如做圆周动作，使加入孔中的反应液混匀。

10.  实验用酶标仪应严格按使用说明书规范操作，并在使用前充分预热。

11.  手工洗板应注意：甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将稀释后的洗涤液至少0.35ml注入孔内，浸泡1-2分钟。根据需要，重复此过程数次。自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。

样本要求

1．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

2．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存或根据存放，时间做相应温度调整，但应避免反复冻融，（由于样本种类过多，每个单位处理方式不一样，本说明书不做详细介绍）。

操作程序

1. 标准品的稀释：（本试剂系统提供原倍标准品一支，用户请按照说明自行在小试管中倍比稀释）按下表格执行：

1. 根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。
2. 加样：1）空白孔：（空白对照孔不加样品，*标记的抗蜕皮激素(Ecdysone)抗体，链霉亲和素-HRP，其余各步操作相同 ；2）标准品孔:加入标准品50μl，链霉亲和素-HRP50μl（标准品中已事先整合好*标记抗体，故在操作时不加，只加*-HRP）；3）样本反应孔：加入样本40μl，然后各加入抗- 蜕皮激素(Ecdysone)抗体10μl、链霉亲和素-HRP（空白孔除外）50μl。盖上封板膜，轻轻振荡混匀，37℃温育60分钟。
3. 配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释备用。
4. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
5. 显色：每孔先加入显色剂A 50μl，再加入显色剂B 50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟。
6. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
7. 测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后10分钟以内进行。

结果判断

1.  每个标准品和标本的OD值应减去零孔的OD值。（若不减零孔值，标准曲线的零孔应相交于Y轴）

2. 根据标准品的浓度及对应的OD值计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样品的OD值在回归方程上计算出对应的样品浓度。也可以使用各种熟悉应用软件来计算。

3．手工绘制标准曲线。以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。推荐使用专业制作曲线软件进行分析计算结果。

4．若标本OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。

操作总结

准备试剂，样品和标准品

加入准备好的样品和标准品，*标记二抗和酶标试剂，37℃反应60分钟。

洗板5次，加入显色液A、B,37℃显色10分钟

   加入TMB终止液

10分钟内酶标仪测OD值

  计算待测样本因子含量

试剂盒性能

1.  准确性：标准品线性回归与预期浓度相关系数R值，大于等于0.9200。
2.  灵敏度：小可检测浓度达，2.03ug/ml。
3.  特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。
4.  重复性：板内、板间变异系数均小于15%。

5 . 回收率：70-110%.

6. 贮藏：2-8℃，避光防潮保存。

7. 有效期：6个月

8. 检测范围：260ug/ml -8.12ug/ml