1.无菌操作室灭菌

    培养材料进行培养、观察或更换培养液时，必须从各方面防止任何污染物进入培养液或容器，所以无菌操作室的灭菌是至关重要的。

    由于无菌操作室的污染来源主要是空气中的细菌和真菌孢子，因此长期停用后的无菌操作室应进行熏蒸灭菌。

    熏蒸是用*+甲醛[(2ml甲醛+1g*)/m3]进行无菌室的灭菌。经常使用的无菌操作室，在每次使用前都应进行地面卫生清洁，并用紫外线灯照射30 min，进行空气灭菌。对超净工作台，每次操作前用紫外灯照射30min，然后用70%～75%酒精擦拭。

 

2.培养液灭菌

    培养液在制备过程中带有各种杂菌，分装后应立即灭菌，或在24小时内完成灭菌工序。目前常用过滤除菌法除去培养物操作液和培养液中的细菌。或对培养液中耐热组分*行高压蒸汽灭菌，然后在无菌室加入经过过滤除菌的不耐热溶液，混匀后分装备用。

    使用高压蒸汽灭菌器灭菌时，将分装好的培养液放入底部有一定量(淹没加热管)凉水的高压蒸汽灭菌器内，增压至0.35~0.4kg/cm2时排净灭菌器内冷空气，以便使蒸汽能到达各个消毒部位，保证消毒灭菌*。然后继续加压加热，当压力表读数达到1.0~1.1kg/cm2为121oC，保持15~20 min即可。由于消毒灭菌效果取决于温度而不是压力，所以在一定压力下保持较长的消毒灭菌时间是必须的。

 

    在121oC的蒸汽温度下可以很快杀死各种细菌及高度耐热的芽孢杆菌，因此许多培养液的消毒灭菌压力、温度一般保持在1.0~1.1 kg/cm2、121oC。消毒灭菌时间与需要消毒灭菌的培养液量密切相关(表2-3)，时间不足达不到灭菌效果，时间过长培养液内的一些化学物质遭到破坏，影响培养液成分。消毒灭菌结束后，关闭热源，只有当灭菌器内压力降为零时才能打开放气阀，排除剩余蒸汽，取出培养液。不可在压力较高时打开放气阀，引起减压沸腾，使容器中液体溢出。