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动物线粒体呼吸链复合物I活性定量检测试剂盒产品说明书
点击次数:893 发布时间:2015-7-11
YIJI动物线粒体呼吸链复合物I活性定量检测试剂盒产品说明书(中文版)
主要用途
YIJI动物线粒体呼吸链复合物I(NADH-辅酶Q还原酶)活性定量检测试剂是一种旨在使用合成辅酶Q同功类似物和抑制复合物,通过反应系统测定样品中特异性氧化还原酶(oxidoreductase)的活性,即采用比色法测定其氧化后双峰差值(NADH浓度)的变化,以此进行测算单位酶活性的而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。其适合于各种组织或细胞的纯化线粒体样品(动物或人体)还原型*腺嘌呤二核苷酸(NADH)-辅酶Q还原酶的特异性活性检测。被用于衰老、能量代谢、蛋白组学、病理生理学、神经病变等研究。产品不含污染性蛋白酶,严格无菌,即到即用,操作简捷,性能稳定,反应优化,检测敏感。
技术背景
线粒体呼吸链复合物I,通常称为还原型*腺嘌呤二核苷酸脱氢酶(reduced nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase;NADH dehydrogenase),是线粒体电子传递链中zui大的结构成分,含有30至40多个多肽结构,其zui特征性的酶活性是鱼藤酮敏感的还原型*腺嘌呤二核苷酸-辅酶Q还原酶(NADH:Q Reductase)。复合物I催化线粒体内电子由供体NADH传递到内膜上辅酶Q受体(泛醌;ubiquinone)的能量转移反应,为整个呼吸链反应系统的*步。NADH-辅酶Q还原酶反应系统测定NADH的浓度变化(340nm和380nm的时间差值),其反应方式为:
氧化还原酶
NADH +H+ + CoQ ≒ NAD- + CoQH2
产品内容
YIJI缓冲液(Reagent A) 毫升
YIJI反应液(Reagent B) 毫升
YIJI阴性液(Reagent C) 毫升
YIJI专性液(Reagent D) 微升
产品说明书 1份
保存方式
保存在-20℃冰箱里,YIJI缓冲液(Reagent A)含有毒性物质,避免直接用手接触;YIJI反应用户自备
比色杯:用于比色的容器
双波长分光光度仪:用于比色分析
实验步骤
实验开始前,将-20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液置入冰槽里融化;YIJI反应液(Reagent B)注意避光。然后进行下列操作。
一、测定准备
1. 准备好待测样品(例如纯化线粒体样品等),置于冰槽里(建议检测前溶解线粒体)
2. 设定好双波长分光光度仪(温度为30℃):波长分别为 nm和 nm,时延 秒,间隔 分钟,读数 次(共 分钟),并置零
二、背景对照测定
3. 移取 微升YIJI缓冲液(Reagent A)到新的比色杯
4. 加入 微升YIJI反应液(Reagent B)
5. 加入 微升YIJI阴性液(Reagent C)
6. 上下倾倒数次,混匀
7. 即刻放入分光光度仪检测,此为背景空对照:
( 波长读数- 波长读数) 分钟-( 波长读数- 波长读数) 分钟
三、样品活性测定
8. 移取 微升YIJI缓冲液(Reagent A)到新的比色杯
9. 加入 微升待测样品
10.加入 微升YIJI反应液(Reagent B)
11.上下倾倒数次,混匀
12.即刻放入分光光度仪检测,此为样品读数:
( 波长读数- 波长读数) 分钟-( 波长读数- 波长读数) 分钟
13.(选择步骤)重复实验步骤8至12,测读新的样品
四、样品失活测定
14.移取 微升YIJI缓冲液(Reagent A)到新的比色杯
15.加入 微升待测样品
16.加入 微升YIJI专性液(Reagent D)
17.加入 微升YIJI反应液(Reagent B)
18.上下倾倒数次,混匀
19.即刻放入分光光度仪检测,此为样品失活读数:
( 波长读数- 波长读数) 分钟-( 波长读数- 波长读数) 分钟
五、计算样品活性
1)样品总活性
[(样品读数-背景读数)X样品稀释倍数]÷[ (样品容量,毫升)X (毫摩尔吸光系数)]=毫摩尔/毫升÷(样品蛋白浓度)毫克/毫升=毫摩尔/毫克或者[(样品读数-背景读数)X样品稀释倍数]÷[ (样品重量,毫克)X (毫摩尔吸光系数)]=毫摩尔/毫克
2)样品特异活性
样品活性测定-样品失活测定=样品特异活性
注意事项
1. 本产品为22次操作,包括1次背景对照测定和1次样品失活测定
2. 所有操作均须无菌状态下进行
3. 操作时,须戴手套
4. YIJI缓冲液(Reagent A)含有毒性物质,避免直接用手接触
5. 系统操作过程中,背景测定和失活测定只需1次
6. 线粒体样品检测前,须溶解;建议冻存融解循环3次或使用YIJI线粒体溶解试剂盒-YJ10018
7. 加样后即刻比色测定
8. 反应1分钟后比色测定值趋于稳定;测定值由高到低变化;测定持续5分钟
9. 测定读数为5分钟和0分钟的差值的值
10.比色测定后,比色杯须清洗*
11.建议待测样本的OD340为0.2至0.8为理想状态
12.如果用户没有双波长同步测定分光光度仪,可以使用单波长340nm替代,注意活性计算时,毫摩尔吸光系数改为6.2
13.样品特异活性是指鱼藤酮敏感的还原型*腺嘌呤二核苷酸-辅酶Q还原酶,排除其它干扰因素(例如复合物II/III/IV等)
14.本公司提供系列线粒体及其酶类技术产品
质量标准
1. 本产品经鉴定性能*稳定
2. 本产品经鉴定检测准确可靠