YIJI动物线粒体呼吸链复合物I活性定量检测试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

YIJI动物线粒体呼吸链复合物I（NADH－辅酶Q还原酶）活性定量检测试剂是一种旨在使用合成辅酶Q同功类似物和抑制复合物，通过反应系统测定样品中特异性氧化还原酶（oxidoreductase）的活性，即采用比色法测定其氧化后双峰差值（NADH浓度）的变化，以此进行测算单位酶活性的而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。其适合于各种组织或细胞的纯化线粒体样品（动物或人体）还原型*腺嘌呤二核苷酸（NADH）－辅酶Q还原酶的特异性活性检测。被用于衰老、能量代谢、蛋白组学、病理生理学、神经病变等研究。产品不含污染性蛋白酶，严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，反应优化，检测敏感。

技术背景

线粒体呼吸链复合物I，通常称为还原型*腺嘌呤二核苷酸脱氢酶（reduced nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase；NADH dehydrogenase）,是线粒体电子传递链中zui大的结构成分，含有30至40多个多肽结构，其zui特征性的酶活性是鱼藤酮敏感的还原型*腺嘌呤二核苷酸－辅酶Q还原酶（NADH:Q Reductase）。复合物I催化线粒体内电子由供体NADH传递到内膜上辅酶Q受体（泛醌；ubiquinone）的能量转移反应，为整个呼吸链反应系统的*步。NADH－辅酶Q还原酶反应系统测定NADH的浓度变化（340nm和380nm的时间差值），其反应方式为：

氧化还原酶

NADH +H＋ + CoQ       ≒      NAD－ + CoQH2

产品内容

YIJI缓冲液（Reagent A）                          毫升

YIJI反应液（Reagent B）                        毫升

YIJI阴性液（Reagent C）                        毫升

YIJI专性液（Reagent D）                        微升

产品说明书           1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里，YIJI缓冲液（Reagent A）含有毒性物质，避免直接用手接触；YIJI反应用户自备

比色杯：用于比色的容器

双波长分光光度仪：用于比色分析

实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液置入冰槽里融化；YIJI反应液（Reagent B）注意避光。然后进行下列操作。

一、测定准备

1．   准备好待测样品（例如纯化线粒体样品等），置于冰槽里（建议检测前溶解线粒体）

2．   设定好双波长分光光度仪（温度为30℃）：波长分别为  nm和  nm，时延  秒，间隔  分钟，读数  次（共  分钟），并置零

二、背景对照测定

3．   移取  微升YIJI缓冲液（Reagent A）到新的比色杯

4．   加入  微升YIJI反应液（Reagent B）

5．   加入  微升YIJI阴性液（Reagent C）

6．   上下倾倒数次，混匀

7．   即刻放入分光光度仪检测，此为背景空对照：

（  波长读数－  波长读数）  分钟－（  波长读数－  波长读数）  分钟

三、样品活性测定

8．   移取  微升YIJI缓冲液（Reagent A）到新的比色杯

9．   加入  微升待测样品

10．加入  微升YIJI反应液（Reagent B）

11．上下倾倒数次，混匀

12．即刻放入分光光度仪检测，此为样品读数：

（  波长读数－  波长读数）  分钟－（  波长读数－  波长读数）  分钟

13．（选择步骤）重复实验步骤8至12，测读新的样品

四、样品失活测定

14．移取  微升YIJI缓冲液（Reagent A）到新的比色杯

15．加入  微升待测样品

16．加入  微升YIJI专性液（Reagent D）

17．加入  微升YIJI反应液（Reagent B）

18．上下倾倒数次，混匀

19．即刻放入分光光度仪检测，此为样品失活读数：

（ 波长读数－  波长读数）  分钟－（  波长读数－  波长读数）  分钟

五、计算样品活性

1）样品总活性

[（样品读数－背景读数）X样品稀释倍数]÷[  （样品容量，毫升）X   （毫摩尔吸光系数）]＝毫摩尔/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝毫摩尔/毫克或者[（样品读数－背景读数）X样品稀释倍数]÷[  （样品重量，毫克）X  （毫摩尔吸光系数）]＝毫摩尔/毫克

2）样品特异活性

样品活性测定－样品失活测定＝样品特异活性

注意事项

1．   本产品为22次操作，包括1次背景对照测定和1次样品失活测定

2．   所有操作均须无菌状态下进行

3．   操作时，须戴手套

4．   YIJI缓冲液（Reagent A）含有毒性物质，避免直接用手接触

5．   系统操作过程中，背景测定和失活测定只需1次

6．   线粒体样品检测前，须溶解；建议冻存融解循环3次或使用YIJI线粒体溶解试剂盒－YJ10018

7．   加样后即刻比色测定

8．   反应1分钟后比色测定值趋于稳定；测定值由高到低变化；测定持续5分钟

9．   测定读数为5分钟和0分钟的差值的值

10．比色测定后，比色杯须清洗*

11．建议待测样本的OD340为0.2至0.8为理想状态

12．如果用户没有双波长同步测定分光光度仪，可以使用单波长340nm替代，注意活性计算时，毫摩尔吸光系数改为6.2

13．样品特异活性是指鱼藤酮敏感的还原型*腺嘌呤二核苷酸－辅酶Q还原酶，排除其它干扰因素（例如复合物II/III/IV等）

14．本公司提供系列线粒体及其酶类技术产品

质量标准

1．   本产品经鉴定性能*稳定

2．   本产品经鉴定检测准确可靠