ELISA的质量控制

       从1949年美国College of American Pathologists（简称CAP）首先开始研究临床实验室室内质量控制（简称质控）问题，美国学者Levery和Jenn ing于1950年发表*篇关于使用质控图的实验室室内质控，临床检验实验室的室内质控工作正式拉序幕。

    到70年代，实验室质量控制进入一个新的阶段--全面质量管理，推行Good Laboratory Parctice（简称GLP）。进入80年代末期，GLP的统一标准产生了，发展到"认证实验室"管理阶段。

    全面质量管理的宗旨在于预防差错的产生。质控图的统计学质控的目的是检出差错。统计学的实验室室内质控是全面质量管理中的一个重 要环节。

    本章节主要介绍免疫学检验的统计学室内质控方法。因为ELISA是目前临床上zui常用的一种免疫学检验方法，就以ELISA检验为例，介绍一下有关问题。

    卫生部临床检验中心免疫质控室从 1988年开始在全国范围内开展乙肝标志物检验的质量评价活动，一直采用这一套质量评价方法，并在实践中不断实践、提高和完善， 希望能找出一条适合中国国情的，行之有效的质量管理的道路。

5.1 基本概念

5.1.1 质量控制（Quaility Control,Q.C）

    质量控制是监视全过程，排除误差，防止变化，维持标准化现状的一个管理过程。这一过程是通过一个反馈环路进行的。
　　1）确定控制的对象；
　　2）规定控制对象的标准（预期值）；
　　3）制定或选择控制方法和手段；
　　3）测量实际数据；
　　4）比较或较对实际数据与预期值之间的差异，并说明产生这一差异的原因。超出预
　　　　定误差范围，报警系发出信号，反馈通道中断。
　　5）采取行动，解决差异。恢复原状（原标准状态）的手段发挥作用。

    质量控制主要采用质控图进行。质控图是把某一检验的性能数据与所计算出来的预期的 "控制限"进行比较的图。这种性能数据是在按规程正常进行时，按时间顺序而抽选出来的，其目的是检测检验过程中变异的"可追查" 性原因。"可追逆"性的误差原因，是指除去随机误差以外的其他原因。"控制限"是通过统计计算出来的，在后我们将详细介绍（见5 .3.室内质控程序）。

5.1.2 误差

    实验误差分为三种：系统误差、随机误差和过失误差。

    系统误差是指一系列测定结果与真值或靶值存在有同一倾向的误差，有明显的规律性，可在一定条件下重复出现，是可以通过质控预防和 校正的。

    随机误差又称偶然误差，是一种偶然的、未能预料到的误差，是难以避免和校正的误差。检验工作中随机误差的分布符合正态分布规律。

    过失误差是人为的责任误差。通过加强实验室管理和开展质量控制工作是可以避免的。

5.1.3 正态分布及标准差

    ELISA试验中，检验同一样本达20次以上时，就会发现这组数据（指测定结果的吸光值）分布在均值两侧，大部分集中在均值附近 。如果以测定值为横坐标，以出现的频率为纵坐标作图，就可绘出一个呈钟形的曲线图。如图5-1，钟顶处为均值，其他值以均值为中 心对称分布，这就是正态分布。

    正态曲线以下的面积称概率，常用样本的均数（X）和标准差（SD）来表示，其计算方法如下：

　　均值、标准差和概率的关系如下：
　　X±1SD，概率0.68　　　　X±2SD，概率0.95　　　　X±3SD，概率0.99

    换言之，当 ELSIA检测同一样本达一定次数后所得的一组数据，其中靠近均值（X）的±1SD范围内的数据，占该组数据的68%，在X±2 SD范围内分布的数据占总体的95%，在X±3SD范围内分布的数据占总体的99%。当我们要求检验结果在X±2SD范围内为合 格时，将有95%的数据可能合格。

5.1.4 真值

    用确切的、的决定性方法测得的值，称为真值。真值一般是测不到的。通过可靠的决定性方法测出的值，称为靶值，通常用靶值来 表示真值的大小。

5.1.5 准确度（accuracy）

    是指测定结果与真值（或靶值）接近的程度。准确度不能以数字表示，往往用不准确度来衡量。测定结果与靶值的偏离程度称为偏差，它 表示该项检验的不准确度。
　　偏差=检验的均值-真值（或靶值）
　　相对偏差=偏差真值÷（或靶值）×100%

5.1.6 精密度（Precision）

 
    是指对同一样本重复测定时，每次测定结果与平均值的接近程度，即重复测定值之间的符合程度。

5.1.7 标准品

1、标准品由WHO或相应组织标定的，用肯定的、*的、准确的物理或化学方法测定的定值材料。

2、生物学活性标准品根据生物学反应由WHO或相应组织标定的活性单位的材料。

3、参考标准血清国家标准化组织根据标准化生产的法定材料。可用于鉴定仪器和鉴定方法准确性。

5.1.8 临床决定性水平（clinical decision leuel）

    当某个被测物的浓度达到某一水平时，临床医师必须采用医疗措施。被测物的这浓度称为临床决定性水平。

5.2质量控制血清

    质控血清是已有靶值的血清，在每次的常规检验中加入一份或数份，通过所得结果来了解本次检验的情况。质控血清检验的结果如能控制 其误差在一定范围内，就说明该检验没有发生不允许的误差。如果出现超过允许误差范围的异常结果，提示该检验不合格，应寻找原因， 纠正后，重检待测标本。因此质控血清在质控工作中起重要作用。

5.2.1 质控血清的使用

    卫生部临床检验中心制备的乙肝标志物质控血清，可以在 -20℃保持半年定值不变。冰冻状态融化使用时，应先混匀，未用完部分可在4℃保存5天。不宜反复冰融或自行分装。开展某项检验 的室内质控工作需要的质控血清，一般按3-6个月用量准备。自制的不定值质控血清，在一批质控血清将用完之前，需准备下一批质控 血清。质控血清要求性能稳定，较长期内效价不变，其理化性质应与病人样本相近，这样才能有效地起到监测作用。

5.2.2 临界值质控血清

    质控制血清分定值和未定值两种。如只用一份质控血清定值，一般定在正常值与异常值交界点上，定性测定时处于弱阳性水平，称为临界 值。乙肝标志物临界值的制定，应按临床要求，为临床提供统一的判断弱阳性的标准。临界值质控血清可以作为试剂盒中的阳性对照品和 阴性对照品以外的第三个对照品，它可以灵敏地反映出试剂盒的检出水平，确保弱阳性反应的标本不漏检。

5.2.3 质控血清的制备

    每个实验室可以根据自己的条件，选用临床中心提供的质控血清，或按以下方法自己制备
本室使用的质控血清（以乙肝质控血清为例）。

1） 收集新鲜的无溶血、无黄疸、无细菌污染的阳性血清。
2） 56℃加热10小时来活。
3） 离心或过滤除去沉淀。
4） 用10%的小牛血清或正常人血清（PBS缓冲液）将收集的血清稀释至所需的浓度。如能用正常的人血清稀释更好，因其成份更接近于检测标本。
5） 抽滤除菌。按一次使用的量分装小安瓿，封口，20℃保存备用。不可反复冻融。
    被检物要求检出的水平常被认为是质控血清应选择的水平。如果该试验还有其它要求，则应加所要求浓度的质控物。
6） 标定含量。20-30次测定结果删除>±2SD数据的均值作为靶值，并与已知定值血清对比测定。

5.3 室内质量控制程序

    临床检验的检测结果，每次或每天之间不可能*。决定允许的误差范围，以临床上不造成误诊与漏诊为准，通过以下步骤来确定质 控范围。
1） *条件下的测定误差。
2） 已知值的血清在常规检验条件下的误差。
3） 未知值的血清在常规检验条件下的误差。
4） 临床应用的要求。对任何一个试验都应确定一个允许的误差范围，前题是满足临床要求。如允许误差定得过小，在临床上不存在任何意义 ，但为了符合该规定却要花费很大人力、物力和时间。相反，如果将允许误差定得过大，将使监测系统察觉不到临床上要求检出的误差， 失去质控的意义。

5.3.1 *条件下已知值质控血清变异（optimal conditions variance,简称OCV）的测定

    在本实验室*条件下（包括操作者、试剂、仪器等）检测质控血清20-30次，测得结果计算，求出该组数据的均值和标准差（SD）表示该实验室的*工作质量。

    现举例说明HBsAg ELISA法检测时OCV的测定。使用的质控制血清为临界血清，HBsAg浓度为5ng/ml。在该实验室中选择素质、操作 zui熟练的技术员进行认真地专门测定，选用*的试剂盒，检测之前，将恒箱、加样器等认真校正、调校正、调试，使用新的加样吸头等 ，即在*、的条件下进行检测。除质控血清外同时测定阴性对照品和阳性对照品。并作双份测定，得出2个吸光值（A值），求 出X。连续作20次，求出20个X，即X1……X20。从这20个数据中，求出OCV的X和SD。

5.3.2常规条件下已知值质控血清变异（routine conditions variance-known value,简称RCVK）的测定。

    做常规检验的技术人员，在常规检验的条件下，将质控血清放在常规检测样本中，进行 20次检验，结果计算同OCV法。一般认为RCV的SD在OCV的SD两倍范围内可以接受。若太大应该查找原因，使其向OCV的 SD值靠近。在改进实验室条件后（例如较正加样器，纠正洗板操作，调正温育温度等），重新进行RCVK的测定。如果RCVK的S D值更小，说明OCV不是*条件下测定的，应重新再测OCV。常规条件下，RCVK肯定要比OCV大。通过质控控制各项条件， 使RCVK的数据尽可能接近OCV值。RCVK的数据反映该实验室日常工作的质量，用于作质控图，对室内检验的结果进行控制，每 日检验的结果，报告能否发出。

5.3.3常规条件下,未知值质控血清变异（routine conditions variancl-unknown value 简称RCVU）的测定

有时为了避免主观性,再作RCVU测定。

    测定步骤同 RCVK，但检测的操作者不知质控血清的定值，或在操作者不知哪份是质控血汪清的条件下进行常规检验，以排除操作者的主观性。在 此不再举例说明。

5.3.4质控图

    通过以上三步骤，可以开始作室内质控图，根据 RCVK的和SD作质控框图。利用质控图可以对每次检验的结果进行监测，当没有更换另一批号试剂盒和另一批号质控血清时，该质控 图可以连续作下去。

    质控血清的S/CO值低于-2SD的范围,属"告警"，应寻找原因并在质控图上记录查出的原因。

    ELISA试验中，各种检验项目的误差允许范围均有待在实践中得出结论，以上只是举例说明质控方法，不是定论。2SD是一般* 的允许误差限度。每批测定放一份质控血清时，一次超过2SD应作为"告警"，二次超出2SD为"失控"。当质控过程中，出现失控 时，出现失控时，应查找原因，通常是试剂盒或质控血清失效造成。更换试剂盒或更换质控血清，找出原因纠正后重新检验。如果检验结 果仍达不到要求或找不到原因时，应重复进行OCV的检验。如果OCV检验的结果仍是好的，说明常规操作出现问题。一般认为：①一 次超出3SD；②连续二次超出2SD；③3-5次连续处于一侧的2SD之内；④5～7次连续偏向横轴的一侧，均为失控。第③、④ 种情况，单独依靠记录往往是不易察觉的，但在质控图上可以清晰地发现这种失控。

5.3.5统计学计算方法--"即刻性"质控

    以上介绍的质控方法基本上与临床化学测定的质控方法相同，但 ELISA有其特殊性，zui合适的质控方法尚待研究建立。有些实验室不是每天进行ELISA项目的检验，而ELSIA试剂盒效期短 ，用一批号试剂盒连续常规测20次，难度较大。采用"即刻法"质控统计方法，只需连续测3次，即可对第3次检验结果进行质控。" 即刻法"的建立具体计算方法如下：
1）先将测定值从小到大排列
2）计算X和SD。
3）计算SDI上限和SDI下限值。
4）将SDI上限、SDI下限值与SDI值中的数字比较。

    当 SDI上限值和SDI下限值＜n2SD时，表示处于控制范围内，可以继续往下测定，继续重复以上各项计算；当SDI上限和SDI 下限有一值处于n2SD和n2SD值之间时，说明该值在2SD~3SD范围，处于"告警"状态；当SDI上限和SDI下限有一值 ＞n2SD时，说明该值已在3SD范围之外，属"失控"。数值处于"告警"和"失控"状态应舍去，重新测定该项质控血清和病人样 本。舍去的只是失控的这次数值，其他次测定值仍可继续使用。

即刻性质控统计方法，适于ELISA测定的质控。

    当检测的数值超过 20次以后，不必再使用"即刻法"质控统计计算，可以转入常规的质控图的质控。将前20次的数值求出的和SD作质控框架图，第2 1次的数值，依次点入即可。

5.4室间质量评价（external quality assessment,简称EQA）

    室间质量评价简称室间质评，是由质控中心采用一系列的办法连续地、客观地评价各实验室的试验结果，并发现室内质控不易发现的不准 确性，了解各实验室之间结果的差异，并帮助校正，使具有可比性。各实验室试验结果报到质控中心，经过统计分析，得出相互比较的结 果。这种评价不能控制各实验室每天发出的检验报告，而是一种回顾性评价。室内质控主要监测试验结果的精密度，而室间质评主要控制 试验结果的准确度，不能互相替代。参与质评的实验室应先做好室内质控。

5.4.1室间质评的方法

1、 发质控物进行调查

    这是国内外室间质评的常用形式。部临检中心对乙肝标志物 ELISA检验的室间质评采用定期发放质控物至各实验室，各实验室在规定的日期进行检验，并将检验结果报至部临检中心。部临检中 心经统计分析，将评价结果寄回各实验室。通过评价，各实验室了解本室工作质量，发现差距，并设法改进，以不断提高检验质量。

    这种评价方式有一定缺点，即各实验室常对质控物特殊对待，在检验时选用特殊试剂盒，选派特别的技术员进行检验，有的实验室互相和 对结果并作修改。这就使EQA的结果不能反映该实验室日常工作水平。

2、 派观察员到实验室进行试剂调查

    这种调查事先不通知，临时派观察员到实验室，采用常规方法，检验规定的一组标本，进行评价。

    这种调查方式，容易发现该实验室存在的实际问题，可以直接给予指导和帮助，解决问题，提高检验质量。这种调查通常可以使用真实样 本，避免采用质控物的一些缺点。