mFluor Violet 540 酸 荧光染料是美国AAT Bioquest生产的mFluor系列。AAT Bioquest的mFluor 染料专为针对多色流式细胞仪的应用而开发。 这些染料具有较大的斯托克斯位移，并且可以被流式细胞仪的激光线（例如405nm，488nm和633nm）很好地激发。该染料的荧光激发和发射值分别为〜405 nm和〜540 nm。 这些光谱特性使其成为Pacific Orange 标记染料的替代品。 是稳定的，并且是制备各种mFluor Violet 540衍生物的常见前体。百萤生物为您提供优质的mFluor Violet 540 酸 荧光染料。
操作方法
注意：该标记方案是针对山羊抗小鼠IgG与mFluor 450 SE的缀合物开发的。 您需根据您的实际情况而定。
1.准备蛋白质储备溶液（溶液A）：
将100μL反应缓冲液（如1 M碳酸钠溶液或1 M磷酸盐缓冲液，pH~9.0）与900μL目标蛋白溶液（如抗体，蛋白质浓度> 2 mg / ml）混合至100μL，以得到1 mL蛋白质标记原液。
注1：蛋白质溶液（溶液A）的pH值应为8.5±0.5。如果蛋白质溶液的pH低于8.0，则使用1M碳酸*钠溶液或1M pH 9.0磷酸盐缓冲液将pH调节至8.0-9.0的范围。
注2：蛋白质应溶解于pH7.2-7.4的1X磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。如果蛋白质溶解在Tris或甘*酸缓冲液中，则必须用pH7.2-7.4的1X PBS透析，以除去用于蛋白质沉淀的游离胺或铵盐（例如硫酸铵和乙酸铵）。
注3：不纯的抗体、稳定的牛血清蛋白（BSA）抗体或明胶不会被很好的标记，叠*化钠或硫柳汞的存在也可能干扰缀合反应。可以通过透析或旋转柱除去叠*化钠或硫柳汞，以获得标记结果。
注4：如果蛋白质浓度低于2 mg / mL，则结合效率会显著降低。为获得标记效率，建议蛋白质浓度范围为2-10 mg / mL。
2.准备染料储备溶液（溶液B）：
将无水DMSO加入到iFluor 染料SE小瓶中以制备10-20mM储备溶液。 通过移液或涡旋混合均匀。
注意：在开始缀合前准备染料储备溶液（溶液B），及时使用。 染料储备溶液的长期储存可降低染料活性。 溶液B可在冰箱中保存两周，避光保存。 避免冻融循环。
3.确定染料/蛋白质比例（可选）：
注意：每种蛋白质都需要不同的染料/蛋白质比例，这也取决于染料的性质。蛋白质的过度标记可能影响其结合亲和力，而低染料/蛋白质比率的蛋白质缀合物会降低灵敏度。我们建议您通过使用连续不同量的标记染料溶液重复步骤4和5来实验确定染料/蛋白质比率。通常，对于大多数染料 - 蛋白质缀合物，推荐使用4-6种染料/蛋白质。
3.1使用10：1摩尔比的溶液B（染料）/溶液A（蛋白质）作为起始点：将5μl染料储备溶液（溶液B，假设染料储备溶液为10 mM）加入到样品瓶中。蛋白质溶液（95μl溶液A）有效摇动。假设蛋白质浓度为10mg / mL并且蛋白质的分子量为~200KD，蛋白质的浓度为~0.05mM。
注意：蛋白质溶液中DMSO的浓度应<10％。
3.2运行缀合反应（参见下面的步骤4）。
3.3重复＃3.2，溶液B /溶液A的摩尔比为5：1;分别为15：1和20：1。
3.4使用预制的旋转柱纯化所需的缀合物。
3.5计算上述4种结合物的染料/蛋白质比（DOS）。
3.6检测上述4种结合物，确定染料/蛋白质比例，以扩大标记反应。
4.运行结合反应：
4.1有效加入适量的染料储备溶液（溶液B）到蛋白质溶液（溶液A）的小瓶中晃动。
注意：溶液B /溶液的摩尔比由步骤3.6确定。如果跳过步骤3，我们建议使用10：1溶液B（染料）/溶液A（蛋白质）的摩尔比。
4.2继续在室温下旋转或摇动反应混合物30-60分钟。
5.纯化缀合物
以下方案是使用Sephadex G-25柱纯化染料 - 蛋白质缀合物的实例。
5.1按照说明书准备Sephadex G-25色谱柱。
5.2将反应混合物（直接从步骤4）加载到Sephadex G-25柱的顶部。
5.3样品在顶部树脂表面下方运行时立即加入PBS（pH 7.2-7.4）。
5.4向所需样品中加入更多PBS（pH 7.2-7.4）以完成色谱柱纯化。
注1：立即使用时，染料 - 蛋白质偶联物需要用染色缓冲液稀释，并等分多次使用。
注2：对于长期储存，染料 - 蛋白质缀合物溶液需要浓缩或冷冻干燥。
