【详细说明】
蛋白质的定量测定(一)-- 凯氏定氮法
目的要求
(1)学习微量凯氏定氮法的原理。
(2)掌握微量凯氏定氮法的操作方法。
实验原理
生物材料的含氮量测定在生物化学研究中具有一定的意义，如蛋白质的含氮量约为16％，测出含氮量则可推知蛋白含量。生物材料总氮量的测定，通常采用微量凯氏定氮法。凯氏定氮法由于具有测定准确度高，可测定各种不同形态样品等两大优点，因而被为是测定食品、饲料、种子、生物制品、药品中蛋白质含量的标准分析方法。其原理如下：
1. 消化：有机物与浓硫酸供热，使有机氮全部转化为无机氮——硫酸铵。为加快反应，添加硫酸铜和硫酸钾的混合物；前者为催化剂，后者可提高硫酸沸点。这一步约需30min至1h，视样品的性质而定。
2. 加碱蒸馏：硫酸铵与NaOH(浓)作用生成(NH4)OH, 加热后生成NH3, 通过蒸馏导入过量酸中和生成NH4Cl而被吸收。
3. 滴定：用过量标准HCl吸收NH3，剩余的酸可用标准NaOH滴定，由所用HCl摩尔数减去滴定耗去的NaOH摩尔数，即为被吸收的NH3摩尔数。此法为回滴法，采用甲基红卫指示剂。HCl＋NaOHNaCl +H2O
本法适用于0.2 ~ 2.0 mg的氮量测定。
1.热源 2. 烧瓶 3. 玻璃管 4. 橡皮管5．玻璃杯 6. 棒状玻塞 7. 反应室 8. 反应室外壳 9. 夹子 10. 反应室中插管 11. 冷凝管 12. 锥形瓶 13. 石棉网
图3.4 微量凯氏蒸馏装置示意图
试剂和器材
一、试剂
浓硫酸；30％；10 M氢氧化钠；0.01M的标准盐酸；标准硫酸铵(0.3mg氮/mL)。
催化剂：硫酸铜：硫酸钾＝1：4混合，研细。
指示剂：0.1％甲基红乙醇溶液。
二、测试样品
牛血清白蛋白。
三、器材
微量凯氏定氮仪；移液管1mL(×3)；2mL(×1)；微量滴定管5mL(×1); 烧杯200mL(×2)；量筒10mL(×1)；三角烧瓶150mL(×4)；凯氏烧瓶50mL(×4)，吸耳球(×1)；电炉；分析天平。
操作方法
一、样品处理
称取牛血清白蛋白50mg，加入2个凯氏烧瓶中，另2个凯氏烧瓶为空白对照，不加样品。分别在每个凯氏烧瓶中加入约500mg硫酸钾－硫酸铜混合物，再加5 mL浓硫酸。
二、消化
将以上4个凯氏烧瓶置于通风橱中电炉上加热。在消化开始时应控制火力，不要使液体冲到瓶颈。待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分解并放出SO2白烟后，适当加强火力，继续消化,使瓶内液体微微沸腾，大约维持2 ~ 3h。待消化液变成褐色后，为了加速完成消化，可将烧瓶取下，稍冷，将30％1 ~ 2滴加到烧瓶底部消化液中，再继续消化，直到消化液由淡黄色变成透明淡蓝绿色，消化即告完成。冷却后将瓶中的消化液倒入50mL容量瓶中，并以蒸馏水洗涤烧瓶数次，将洗液并入容量瓶中，定容备用。
三、蒸馏
1. 蒸馏器的洗涤
蒸气发生器中盛有加有数滴H2SO4的蒸馏水和数粒沸石。加热后，产生的蒸汽经贮液管、反应室至冷凝管，冷凝液体流入接受瓶。每次使用前，需用蒸汽洗涤10分钟左右(此时可用一小烧杯承接冷凝水)。将一只盛有5mL 2％硼酸液和1 ~ 2滴指示剂的锥形瓶置于冷凝管下端，使冷凝管管口插入液体中，继续蒸馏1 ~ 2分钟，如硼酸液颜色不变，表明仪器已洗净。
2. 消化样品及空白的蒸馏
取50mL 锥形瓶数个，各加25mL 0.01M标准HCl和1 ~ 2滴指示剂，用表面皿覆盖备用。
取2mL 稀释消化液，由小漏斗加入反应室。将一个装有0.01M标准HCl和指示剂的锥形瓶放在冷凝管下，使冷凝器管口下端浸没在液体内。
用小量筒量取5mL 10M NaOH溶液，倒入小漏斗，让NaOH溶液缓慢流入反应室。尚未尽时，加紧夹子，向小漏斗加入约5mL蒸馏水，同样缓缓放入反应室，并留少量水在漏斗内作水封。加热水蒸气发生器，沸腾后，关闭收集器活塞。使蒸汽冲入蒸馏瓶内，反应生成的NH3逸出被吸收。待氨已蒸馏，移动锥形瓶使液面离开冷凝管口约1cm，并用少量蒸馏水冷凝管口。取下锥形瓶，以0.01M NaOH标准溶液滴定。记下所耗去的体积。
3. 蒸馏后蒸馏器的洗涤
蒸馏完毕后，移取热源，夹紧蒸汽发生器和收集器间的橡皮管，此时由于收集器温度突然下降，即可将反应室残液吸至收集器。
- 标准样品的测定
在蒸馏样品及空白前，为了练习蒸馏和滴定操作，可用标准硫酸铵试做实验2 ~ 3次。
标准硫酸铵的含氮量是0.3mg/mL，每次实验取2.0mL。
四、计算
样品的含氮量(mg/mL)=
若测定的蛋白质含氮部分只是蛋白质(如血清)，则：
样品中蛋白质含量(mg/mL)＝
式中：A为滴定空白用去的NaOH平均mL数，B为滴定样品用去的NaOH平均mL数，V为样品的mL数，0.01 NaOH的摩尔浓度，14为氮的原子量，6.25为系数(蛋白质的平均含氮量为16％，由凯氏定氮法测出含氮量，再乘以系数6.25即为蛋白质量)，N为样品的稀释倍数。
注意事项
(1)必须仔细检查凯氏定氮仪的各个连接处，保证不漏气。
(2)凯氏定氮仪必须事先反复清洗，保证洁净。
(3)小心加样，切勿使样品沾污口部、颈部。
(4)消化时，须斜放凯氏烧瓶(45o左右)。火力先小后大，避免黑色消化物溅到瓶口、瓶颈壁上。
(5)蒸馏时，小心加入消化液。加样时将火力拧小或撤去。蒸馏时，切记火力不稳，否则将发生倒吸现象。
(6)蒸馏后应及时清洗定氮仪。
【详细说明】
蛋白质的定量测定(一)-- 凯氏定氮法
目的要求
(1)学习微量凯氏定氮法的原理。
(2)掌握微量凯氏定氮法的操作方法。
实验原理
生物材料的含氮量测定在生物化学研究中具有一定的意义，如蛋白质的含氮量约为16％，测出含氮量则可推知蛋白含量。生物材料总氮量的测定，通常采用微量凯氏定氮法。凯氏定氮法由于具有测定准确度高，可测定各种不同形态样品等两大优点，因而被为是测定食品、饲料、种子、生物制品、药品中蛋白质含量的标准分析方法。其原理如下：
1. 消化：有机物与浓硫酸供热，使有机氮全部转化为无机氮——硫酸铵。为加快反应，添加硫酸铜和硫酸钾的混合物；前者为催化剂，后者可提高硫酸沸点。这一步约需30min至1h，视样品的性质而定。
2. 加碱蒸馏：硫酸铵与NaOH(浓)作用生成(NH4)OH, 加热后生成NH3, 通过蒸馏导入过量酸中和生成NH4Cl而被吸收。
3. 滴定：用过量标准HCl吸收NH3，剩余的酸可用标准NaOH滴定，由所用HCl摩尔数减去滴定耗去的NaOH摩尔数，即为被吸收的NH3摩尔数。此法为回滴法，采用甲基红卫指示剂。HCl＋NaOHNaCl +H2O
本法适用于0.2 ~ 2.0 mg的氮量测定。
1.热源 2. 烧瓶 3. 玻璃管 4. 橡皮管5．玻璃杯 6. 棒状玻塞 7. 反应室 8. 反应室外壳 9. 夹子 10. 反应室中插管 11. 冷凝管 12. 锥形瓶 13. 石棉网
图3.4 微量凯氏蒸馏装置示意图
试剂和器材
一、试剂
浓硫酸；30％；10 M氢氧化钠；0.01M的标准盐酸；标准硫酸铵(0.3mg氮/mL)。
催化剂：硫酸铜：硫酸钾＝1：4混合，研细。
指示剂：0.1％甲基红乙醇溶液。
二、测试样品
牛血清白蛋白。
三、器材
微量凯氏定氮仪；移液管1mL(×3)；2mL(×1)；微量滴定管5mL(×1); 烧杯200mL(×2)；量筒10mL(×1)；三角烧瓶150mL(×4)；凯氏烧瓶50mL(×4)，吸耳球(×1)；电炉；分析天平。
操作方法
一、样品处理
称取牛血清白蛋白50mg，加入2个凯氏烧瓶中，另2个凯氏烧瓶为空白对照，不加样品。分别在每个凯氏烧瓶中加入约500mg硫酸钾－硫酸铜混合物，再加5 mL浓硫酸。
二、消化
将以上4个凯氏烧瓶置于通风橱中电炉上加热。在消化开始时应控制火力，不要使液体冲到瓶颈。待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分解并放出SO2白烟后，适当加强火力，继续消化,使瓶内液体微微沸腾，大约维持2 ~ 3h。待消化液变成褐色后，为了加速完成消化，可将烧瓶取下，稍冷，将30％1 ~ 2滴加到烧瓶底部消化液中，再继续消化，直到消化液由淡黄色变成透明淡蓝绿色，消化即告完成。冷却后将瓶中的消化液倒入50mL容量瓶中，并以蒸馏水洗涤烧瓶数次，将洗液并入容量瓶中，定容备用。
三、蒸馏
1. 蒸馏器的洗涤
蒸气发生器中盛有加有数滴H2SO4的蒸馏水和数粒沸石。加热后，产生的蒸汽经贮液管、反应室至冷凝管，冷凝液体流入接受瓶。每次使用前，需用蒸汽洗涤10分钟左右(此时可用一小烧杯承接冷凝水)。将一只盛有5mL 2％硼酸液和1 ~ 2滴指示剂的锥形瓶置于冷凝管下端，使冷凝管管口插入液体中，继续蒸馏1 ~ 2分钟，如硼酸液颜色不变，表明仪器已洗净。
2. 消化样品及空白的蒸馏
取50mL 锥形瓶数个，各加25mL 0.01M标准HCl和1 ~ 2滴指示剂，用表面皿覆盖备用。
取2mL 稀释消化液，由小漏斗加入反应室。将一个装有0.01M标准HCl和指示剂的锥形瓶放在冷凝管下，使冷凝器管口下端浸没在液体内。
用小量筒量取5mL 10M NaOH溶液，倒入小漏斗，让NaOH溶液缓慢流入反应室。尚未尽时，加紧夹子，向小漏斗加入约5mL蒸馏水，同样缓缓放入反应室，并留少量水在漏斗内作水封。加热水蒸气发生器，沸腾后，关闭收集器活塞。使蒸汽冲入蒸馏瓶内，反应生成的NH3逸出被吸收。待氨已蒸馏，移动锥形瓶使液面离开冷凝管口约1cm，并用少量蒸馏水冷凝管口。取下锥形瓶，以0.01M NaOH标准溶液滴定。记下所耗去的体积。
3. 蒸馏后蒸馏器的洗涤
蒸馏完毕后，移取热源，夹紧蒸汽发生器和收集器间的橡皮管，此时由于收集器温度突然下降，即可将反应室残液吸至收集器。
- 标准样品的测定
在蒸馏样品及空白前，为了练习蒸馏和滴定操作，可用标准硫酸铵试做实验2 ~ 3次。
标准硫酸铵的含氮量是0.3mg/mL，每次实验取2.0mL。
四、计算
样品的含氮量(mg/mL)=
若测定的蛋白质含氮部分只是蛋白质(如血清)，则：
样品中蛋白质含量(mg/mL)＝
式中：A为滴定空白用去的NaOH平均mL数，B为滴定样品用去的NaOH平均mL数，V为样品的mL数，0.01 NaOH的摩尔浓度，14为氮的原子量，6.25为系数(蛋白质的平均含氮量为16％，由凯氏定氮法测出含氮量，再乘以系数6.25即为蛋白质量)，N为样品的稀释倍数。
注意事项
(1)必须仔细检查凯氏定氮仪的各个连接处，保证不漏气。
(2)凯氏定氮仪必须事先反复清洗，保证洁净。
(3)小心加样，切勿使样品沾污口部、颈部。
(4)消化时，须斜放凯氏烧瓶(45o左右)。火力先小后大，避免黑色消化物溅到瓶口、瓶颈壁上。
(5)蒸馏时，小心加入消化液。加样时将火力拧小或撤去。蒸馏时，切记火力不稳，否则将发生倒吸现象。
(6)蒸馏后应及时清洗定氮仪。
