人巨细胞病毒 （HCMV）核酸扩增检测试剂盒说明书
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【名称】
通 用 名：人巨细胞病毒 （HCMV）核酸扩增检测试剂盒说明书
英 文 名：Human Cytomegalovirus Fluorescence quantitative Polymerase Chain Reaction （PCR）Diagnostic kit
汉语拼音：ren ju xi bao bing du （HCMV）he suan kuo zeng jian ce shi ji he
【目的】本试剂盒适用于检测血液（全血或血清）、尿液、乳汁等样本中人巨细胞病毒 （HCMV）DNA，用于人巨细胞病毒 （HCMV）感染的辅助诊断及其感染病人药物治疗的疗效监控。其检测结果仅供临床参考。
【原理】本试剂盒选取一对人巨细胞病毒（HCMV）特异性引物和一条特异性荧光探针，应用碱裂解法提取DNA，后者在耐热DNA聚合酶（Taq酶）作用下，配以FQ-Buffer（内含Mg2+、Tris-HCl等）、四种核苷酸单体（dNTPs）等成分，通过PCR-荧光探针体外扩增法对人巨细胞病毒（HCMV）一段高保守区域进行扩增，从而达到快速实时定量检测之目的。
【组成】
名 称 | 数量 | 规格 |
核酸提取液A | 2管 | 2000μl/管 |
核酸提取液B | 4管 | 500μl/管 |
Taq 酶系 | 1管 | 80μl/管 |
HCMV–PCR MIX | 1管 | 960μl/管 |
HCMV阳性质控品 | 1管 | 50μl/管（1×10P7PCopies/ml） |
阴性质控品 | 1管 | 500μl/管 |
备注：10×RCLB等另行配备。
【标本采集】
1. 适用标本：血液（全血或血清）、尿液、乳汁等。
2. 标本采集：
血清：*抽取待检者静脉血2ml，置于干燥管中，充分混匀，密闭送检。
全血：*抽取待检者静脉血2ml，置于*抗凝管中，充分混匀，密闭送检。
尿液：取晨尿10-50ml置于无菌50ml离心管中，3,000g离心5min，弃上清，沉淀加1ml生理盐水，混匀后转至一洁净的1.5ml离心管中，密闭送检。
乳汁：取乳汁5-10ml置于无菌玻璃管中，密闭送检。
【适用仪器】主要包括ABI GeneAmp PCR System7700、ABI GeneAmp PCR System7500、ABI PRISM 7300、LightCycler等毛细管的仪器，MJ Opticon系列或取得资格认证的定量PCR仪。
【保存和运输】 标本可立即用于测试，也可保存于-20℃待测，保存期为6个月。
【使用方法】
1． DNA提取
1.1全血：按下述步骤操作，用户也可用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞。
1.1.1将抗凝血摇匀，取500μl转至一洁净的1.5ml 离心管中，编号标记。
1.1.2 加入1ml 1×红细胞裂解液（RCLB,试剂盒配备10×RCLB，使用前请用双蒸馏水按1：9比例配制成1×RCLB），剧烈震荡30s，3000g离心5min，弃上清。
1.1.3 重复 1.1.2 两至三次至无明显红色沉淀。（若沉淀明显，请再重复步骤1.1.2 一次）。
1.1.4 加入1ml生理盐水，剧烈震荡15s，13,000g离心1min，弃上清。
1.2 血清、尿液、乳汁：处理前请充分混匀，取标本100μl，加入100μl等量核酸提取液A，充分混匀，13,000rpm离心3分钟，弃上清（勿碰及下面沉淀），沉淀加50μl核酸提取液B，100℃处理10分钟，13,000rpm离心3分钟，取上清液4μl做PCR反应。
阴性质控品：取50μl阴性质控品，加50μl核酸提取液B充分混匀（提取液用前需室温溶解并充分混匀）后100℃10分钟，13,000rpm离心3分钟，取上清液4μl做PCR反应。
HCMV阳性质控品：直接取4μl进行PCR扩增，或按照PCR扩增介绍方法进行定量分析。
2．PCR扩增
从试剂盒中取出HCMV-PCR MIX、Taq酶系，室温融化并振荡混匀后，10,000rpm离心10s。
设所需要的PCR反应管管数为N（N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照），每个测试反应体系配制如下表：
试剂 | HCMV-PCR MIX | Taq酶系 |
用量 | 24μl | 2μl |
计算好各试剂的使用量，加入一适当体积洁净离心管中，充分混匀，10,000rpm离心10s，向设定的N个PCR反应管中分别加入26μl，向每管中加入处理后样品或HCMV-阳性定量标准品（使用前用阴性质控品梯度稀释10倍、100倍、1000倍，记为1×10P6PCopies/ml，1×10P5PCopies/ml，1×10P4PCopies/ml）和阴性质控品4μl，10,000rpm瞬时离心30秒。将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内，按对应顺序设置阴性质控品，阳性定量标准品以及未知标本，并设置反应体积（30μl）、样品名称、标记荧光基团种类（报告基团为FAM，淬灭基团为TAMRA）和循环条件:
ABI PRISM 7700，ABI PRISM5700，ABI GeneAmp 7000 （需要剪掉反应盖），ABI PRISM7300/7500（使用8联管），MJ Opticon（使用8联管）等使用薄壁管的仪器，循环条件：94℃→2分钟，后93℃ 30秒→55℃ 45秒， 40个循环。
LightCycler等使用毛细管的仪器，循环条件：94℃→2分钟，后93℃ 5秒→56℃ 45秒，共40个循环。
3．结果分析判定
反应结束后保存检测数据文件。根据分析后图像调节baseline的start值（3~8），stop值（13~18）以及Threshold值，使Std curve 窗口下的标准曲线达到*（correlation数值介于-0.97~-1之间，correlation数值等同于∣r∣值），zui后到Reporter窗口下记录仪器自动分析计算出的未知标本数值（Qty-Copies/ml）。
【质控标准】
阴性质控品：全部阴性。没有荧光值增长。
HCMV-阳性质控品：阳性质控品的 Ct 值均应小于 35.0。
∣r∣≥0.97（correlation数值介于-0.97~-1之间，correlation数值等同于∣r∣值）。
以上条件应同时满足 ，否则，此次试验视为无效，全部试验应重新进行。
【结果判定】
测定结果的计算：
如果Ct值﹤38，则实验样品的HCMV- DNA含量（基因拷贝数/ml）= Qty-Copies/ml；
如果38﹤Ct值﹤40,为灰区建议重新检测，重新检测若38﹤Ct值﹤40判为阳性，否则为阴性。
如果Ct值=40，则HCMV-DNA含量（基因拷贝数/ml）﹤1×10P2PCopies/ml （低于检测下限）。
【注意事项】
使用前请仔细阅读说明书。并且严格按照说明书进行操作。
试剂盒内各种组分使用前应充分融化混匀并经高速短暂离心后试用。每盒试剂请于3 次内使用完毕。
试剂盒须避光保存，以免荧光物质衰减。所有使用的离心管、 Tip 头应高压灭菌，而且必须不含 DNase。
PCR操作应严格按照要求分区（试剂配制区、标本处理区、PCR扩增区等），防止实验室污染。
试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。
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