实验原理

* 是以无活性的酶原形式存在于动物胰脏中，在Ca2+的存在下，被肠激酶 或有活性的* 自身激活，从肽链N端赖氨酸和异*残基之间的肽键断开，失去一段六肽，分子构象发生一定改变后转变为有活性的*。

*原的分子量约为24000，其等电点约为pH8.9，*的分子量与其酶原接近（23300），其等电点约为pH10.8，zui适pH7.6～8.0，在pH=3时zui稳定，低于此pH时，*易变性，在pH>5时易自溶。Ca2+离子对*有稳定作用。

重金属离子，有机磷化合物和反应物都能抑制*的活性，胰脏、卵清和豆类植物的种子中都存在着蛋白酶抑制剂 。zui近发现在一些植物的块基（如土豆、白薯、芋头等）中也存在有*抑制剂 。

*能催化蛋白质的水解，对于由碱性氨基酸 （*、赖氨酸）的羧基与其他氨基酸 的氨基所形成的键具有高度的专一性。此外还能催化由碱性氨基酸和羧基形成的酰胺键或酯键，其高度专一性仍表现为对碱性氨基酸一端的选择。*对这些键的敏感性次序为：酯键> 酰胺键> 肽键。因此可利用含有这些键的酰胺或酯类化合物作为底物来测定*的活力。目前常用苯甲酰-L-*-对硝基苯胺（简称BAPA）和苯甲酰-L-*-β-萘酰胺（简称BANA）测定酰胺酶活力。用苯甲酰-L-*乙酯（简称BAEE）和对甲苯磺酰-L-*甲酯（简称TAME）测定酯酶 活力。本实验以BAEE为底物，用紫外吸收法测定*活力。酶活力单位的规定常因底物及测定方法而异。

从动物胰脏中提取*时，一般是用稀酸溶液将胰腺细胞中含有的酶原提取出来，然后再根据等电点沉淀的原理，调节pH以沉淀除去大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质，再以硫酸铵分级盐析将*原等（包括大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质，再以硫酸铵分级盐析将*原等（包括大量*原和弹性蛋白酶原）沉淀析出。经溶解后，以极少量活性*激活，使其酶原转变为有活性的*（*和弹性蛋白酶同时也被激活），被激活的酶溶液再以盐析分级的方法除去*及弹性蛋白酶等组分。收集含*的级分，并用结晶法进一步分离纯化。一般经过2～3次结晶后，可获得相当纯的*，其比活力可达到8000～10000BAEE单位/毫克蛋白，或更高。

如需制备更纯的制剂，可用上述酶溶液通过亲和层析方法纯化。

试剂和器材

一、试剂

pH2.5乙酸酸化水；2.5mol/L H2SO4；5 mol/L NaOH；2 mol/L NaOH；2mol/L HCl；0.001M

HCl；硫酸铵；氯化钙。

0.8 mol/L pH9.0硼酸缓冲液：取20ml 0.8 mol/L硼酸溶液，加80ml 0.2 mol/L四硼酸钠溶液，混合后，用pH计检查校正。

0.4 mol/L pH9.0硼酸缓冲液（用0.8 mol/L稀释1倍即可）；

0.2 mol/L pH8.0硼酸缓冲液：取70ml 0.2 mol/L硼酸溶液，加30ml 0.5 mol/L四硼酸钠溶液，混合后，用pH计校正。

0.05 mol/L pH8.0 Tris －HCl 缓冲液：取50mL 0.1 mol/LTris 加29.2 mL mol/L HCl 加水定容至100mL。

底物溶液的配制：即每毫升0.05 mol/L pH8.0 Tris－HCl 缓冲液中加0.34毫克BAEE和2.22毫克的氯化钙。

二、材料

新鲜或冰冻猪胰脏

三、仪器

食品加工机和高速分散器；研钵 ；大玻璃漏斗 ；布氏漏斗 ；抽滤瓶；纱布；恒温水浴 ；紫外分光光度计 ；秒表；pH试纸 。

操作方法

一、猪*制备

（一）猪*原的提取

猪胰脏1.0Kg（新鲜的或杀后立即冷藏的），除去脂肪和结缔组织后，绞碎。
加入2倍体积预冷的乙酸酸化水（pH2.5）于10～15℃搅拌提取24小时，四层纱
布过滤得乳白色滤液，用2.5M H2SO4调pH至2.5～3.0，放置3～4小时后用折迭滤纸 过滤得黄色透明滤液（约1.5升）。

加入固体硫酸铵（予先研细），使溶液达0.75饱和度（每升滤液加492克）放置过
夜后抽滤（挤压干），得猪*原粗制品。