1．石蜡切片脱蜡至水：（石蜡切片染色前应置 60℃ 1 小时） 。

       ① 二甲苯 、II，各 10 分钟。
       ② 梯度酒精：100%，2 分钟  95%，2 分钟  80%，2 分钟  70%  2 分钟。
       ③ 蒸馏水洗：5 分钟，2 次（置于摇床）。

2．过氧化氢封闭内源性过氧化物酶：3%H₂ O₂ ，室温 10 分钟（避光） 。

3．蒸馏水洗：5 分钟，2 次（置于摇床） 。

4．抗原修复：根据待检测的抗原，选择适当的方法。

附：抗原修复液（10mMpH 6.0 *缓冲液）的配制：① 储备液的配制：A 液：枸橼酸三钠- 2H₂O 29.41g + 蒸馏水 1000ml；B 液：枸橼酸 21g + 蒸馏水 1000ml；② 工作液的配制：A 液 82ml+ B 液 18ml+ 蒸馏水 900ml

抗原修复的方法： ① 高压锅处理技术：*缓冲液（10mM，PH6.0），淹没切片，盖上锅盖，高压锅内煮沸，上汽 3 分钟后缓慢冷却（可用自来水在高 压锅外冲，以助冷却） 。② 微波处理技术：用塑料切片架，置于塑料或耐温玻璃容器内，枸橼酸 钠缓冲液淹没切片，选择中高或,5 分钟;取出并补充已预热的 *缓冲液； 再选择中高或，5分钟（.*温度为 92 95℃）③ 酶消化处理。

抗原修复的注意事项：① 组织不能干。 ② 选择抗原修复方法要因抗体而异。 ③ 该方法主要用于 10%福尔马林固定、石蜡包埋组织。④ 抗原修复后至 DAB 显色的过程中，均需用 PBS 缓冲液。

5．PBS：5 分钟，2 次（置于摇床） 。

6．正常血清封闭：从染片缸中取出切片，擦净切片背面水分及切片正面组织周围的水分 （保持组织呈湿润状态,）滴加正常山羊或兔血清 （与第二抗 体 同源动物血清）处理，37℃，15 分钟。

附：正常血清配制 （ 或按试剂盒规定的浓度配制）：按 1:20比例，用 PBS 配制，每张切片需要量按 50μ+5μl （10%抛洒量） 计算。

7．滴加*抗体：用滤纸吸去血清，不洗，直接滴加*抗体，37℃ 2 小时（也可置于 4℃冰箱过夜） 。

8．PBS：5 分钟，2 次（置于摇床） 。

9．滴加*化的二抗，37℃，40 分钟。

10．PBS：5 分钟，2 次（置于摇床） 。

11．滴加三抗 （SAB 复合物） ，37℃，40 分钟。

12．PBS：5 分钟，2 次（置于摇床） 。

13．DAB 显色，镜下观察，适时终止（自来水冲终止） 。

附：DAB 的配制① 储备液（DAB 25mg/ml）的配制：DAB 250mg + PBS 10ml，待*溶解后分装成 1ml，100μl，50μl ，20μ l 等，-20℃，冻存。② 工作液：DAB 储备液 20μl + PBS 1000μl + 3% H₂O ₂  5μl

14．自来水（细水）充分冲洗。

15．苏木素复染，室温，30 秒，自来水冲洗。

16．自来水冲洗返蓝，15 分钟。

17．梯度酒精脱水：80%，2 分钟  95%，2 分钟  100%，2 次，5 分钟。

18．二甲苯透明：I ，II （二甲苯）各 5 分钟

19．封片：加拿大树胶（或中性树胶）封片。