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上海哈灵生物科技有限公司
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总 RNA 样品 mRNA 选择纯化试剂盒实验步骤
2024-6-26 阅读(109)
实验步骤详细指南：
实验准备：
从-20℃冰箱中取出亲和液(Reagent B)，置于冰槽内融化，并摇匀。
预热洗脱液(Reagent E)至65℃在恒温水槽中。
实验流程：
一、RNA样品准备
从-70℃冰箱中取出总RNA样品，解冻于冰槽内。
准确移取500微升(总量为0.5至1毫克总RNA)至新的1.5毫升离心管中。
二、RNA样品处理
加入适量的平衡液(Reagent A)，涡旋震荡5秒，确保混合均匀。
瞬时离心15秒，去除气泡。
将处理后的RNA溶液移入含有亲和液(Reagent B)的离心管中。
再次涡旋震荡5秒，确保混合均匀。
室温下，在平式摇荡仪上以100RPM的速度孵育10分钟。
瞬时离心15秒，去除上清液。
三、洗涤与纯化
加入适量的高盐液(Reagent C)，混匀后瞬时离心15秒，去除上清液。
重复上述洗涤步骤两次。
加入适量的低盐液(Reagent D)，混匀后瞬时离心15秒，去除上清液。
再次加入低盐液(Reagent D)，混匀后转移至离心柱中。
四、RNA洗脱与收集
瞬时离心15秒，更换收集管。
加入预热至65℃的洗脱液(Reagent E)，室温静置1分钟。
离心2分钟，速度为16000g(例如使用eppendorf 5415离心机时，转速为13000RPM)。
重复上述洗脱步骤一次。
五、RNA沉淀与干燥
丢弃离心柱，加入浓缩液(Reagent F)和沉淀液(Reagent G)，混匀。
可选择性地放入-70℃冰箱中孵育10分钟。
离心15分钟，速度为16000g，去除上清液。
加入净化液(Reagent H)，4℃离心5分钟，去除上清液。
在空气中晾干RNA样品。
六、RNA保存与浓度测定
加入适量的保存液(Reagent I)，溶解RNA。
将RNA样品放入-70℃冰箱中储存备用。
七、mRNA浓度测定(可选)
移取1微升mRNA样品至1.5毫升离心管中。
加入适量的保存液(Reagent I)，混匀。
将混合液移入100微升规格的石英比色杯中。
使用分光光度仪，在260nm波长下测定OD值。
根据公式：浓度(微克/微升)=OD260 X 4，计算mRNA的浓度。
注意事项：
所有操作均需在冰上进行，以保持RNA的稳定性。
使用前请确保所有试剂均已摇匀，并避免交叉污染。
离心过程中请确保离心管平衡，避免损坏离心机。
洗涤和纯化步骤是确保RNA纯度和质量的关键，请务必按照步骤操作。
测定mRNA浓度时，请确保分光光度仪已校准，并选择合适的波长。
以上内容仅供参考，具体以纸质版说明书为准
