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海洋大学大鼠ELISA实验报告
2013-10-18 阅读(1564)
海洋大学大鼠ELISA实验报告
实验名称：
酶联免疫吸附剂测定
实验原理：
酶联免疫吸附测定是一种免疫测定技术。测定中，先使抗原吸附在固相载体上，然后加待测的抗体，再用某种酶标记抗体，形成抗原-抗体-酶标记抗体的“双抗体夹心”，此时酶仍保有活性，同时标记抗体亦有免疫活性。之后再加入酶的底物，在酶的催化下产生反应并产生有色物，颜色深浅与待测物质的量直接相关。至此，酶的催化放大作用与免疫反应的特异性相结合，提高了测定的准确性与灵敏度。
实验材料与试剂：
1．聚苯乙烯微量细胞培养板（平板, 96孔）。
2．酶联免疫检测仪。
3．辣根过氧化物酶羊抗兔IgG。
4．包被液：0.05 mol/L 碳酸缓冲液（pH 9.6）： Na2CO3 0.15g, NaHCO3 0.293g， 蒸馏水稀释至100 ml。
5．稀释液（PBS-Tween）： NaCl 8g, KCl 0.2g， KH2PO4 0.2g, Na2HPO4·12H2O 2.9g, Tween-20，0.5ml，蒸馏水加至1000ml。
6．洗涤液：同稀释液。
7．封闭液：0.5 % （质量分数）BSA（用PBS配制）。
8．邻苯二胺溶液（底物）： 配制： 0.1 mol/L 柠檬酸 （2.1g/100ml）, 取6.1ml， 0.2 mol/L Na2HPO4·12H2O （7.163g/100ml）, 取6.4ml, 加蒸馏水12.5ml, 取邻苯二胺8mg（溶解）； 临用前加30 % （体积分数）H2O2 40μl。
9．终止液：2 mol/L H2SO4。
实验步骤：
1．包被抗原： 用包被液将抗原作适当稀释, 一般为1~10μg/孔，每孔加200μl, 37 ℃温育30min。
2．洗涤：倒尽板孔中液体，加200μl洗涤液，反复三次，zui后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。
3．加封闭液200μl，37 ℃温育30min。
4．洗涤同2。
5．加被检血清： 用稀释液将被检血清作几种稀释，每孔200μl。同时作稀释液对照。37 ℃温育30min。
6．洗涤同2。
7．加辣根过氧化物酶羊抗兔IgG, 每孔200μl, 37 ℃温育30min。
8．洗涤同2。
9．加底物：邻苯二胺溶液加200μl，室温暗处5min。
10．加终止液：每孔50μl。
11．观察结果：用酶联免疫检测仪记录OD490nm读数。
实验结果：
数据如下：
实验讨论：
1．无一抗（10）数据值存在异常。理论上应趋近于零。可能是由于受污染所致，实验现象比较清晰，随浓度由浓到稀，颜色由深黄渐变为浅黄。
2．线性关系比较明显。但斜率随浓度减小而有所增大。这可能是在使用取液器时有气泡混入，导致实际浓度低于理论上的浓度。
3．组号（2）（4）（5）中3个样本数据差别较大，可能是因为配血清时混合不够均匀所致。
这个实验采用了间接法测定，利用酶的催化放大作用提高了检测的灵敏度。作为一名精仪系的学生，这给予我的启示就是，在直接测量精度如果遇到瓶颈时，没有合适的方法提高精度，那么可以考虑寻找一个“中介”，而这个“中介”应该具有“在变量产生微小变化时能放大这种变化，或者用另一种形式体现这种变化”的特性，从而测量变得可行。而该实验中，zui终效果就是我们可以直接通过颜色深浅大致看出浓度的不同。这一点很值得思考。
另外由于操作不熟练、不仔细，也带来了一些粗大误差，如无一抗（10）。这是我们实验中应该避免的。
