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上海哈灵生物科技有限公司
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土壤脱氢酶试剂盒操作方式
2021-5-4 阅读(542)
土壤脱氢酶（Soil dehydrogenase, sDHA）试剂盒说明书
（分光光度法 50 管/48 样）
注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：
土壤脱氢酶(Soil dehydrogenase, sDHA)的活性可以反映土壤体系内活性微生物量以及其对有机物的降解活性，可以作为土壤微生物的降解性能指标。
测定原理：
氢受体 2, 3, 5 - 氯化三苯基四氮唑（2,3,5-Triphenyl Tetrazolium Chloride, TTC）在细胞呼吸过程中接受氢以后，被还原为三苯基甲鐟（Triphenyl Formazone, TF），TF 呈现红色，在波长 485nm 处有大吸收峰，采用分光光度法于 485nm 测定其吸光值，即得土壤脱氢酶活性。
自备实验仪器及用品：
筛子、天平、恒温培养箱或水浴锅、低温离心机、可见分光光度计、玻璃比色皿，冰、蒸馏水、甲醇（不允许快递，请用户自备）。
试剂的组成和配制：
试剂一：粉剂×1 瓶，使用前加 10mL试剂二溶解，4℃避光保存（尽量现配现用）。
试剂二：液体 20mL×1 瓶，4℃保存。
试剂三：自备甲醇。
试剂四：200μg/mL标准液1mL×1 支，4℃避光保存。
样品处理：
新鲜土样自然风干或者37℃烘箱烘干，过30-50目筛
测定步骤和操作表：
测定管 空白管 标准管
土样（g） 0.1
标准液（μL） 200
试剂一应用液（μL） 200 200
试剂二（μL） 200
充分混匀，37℃，暗培养 24h（标准管无需反应24h，可在测定、空白管暗培养24h后再测）
甲醇（μL） 1800 1800 1600
避光反复震荡1小时，8000g，离心 5min，取上清 1mL 于 1mL光径玻璃比色皿，测定A485。空白只要做1管。
（标准管用于制作标准曲线，参考附录I）
酶活单位定义：在 37℃时，每克土壤样品每天催化产生 1μg TF 为一个酶活性单位。
脱氢酶活力计算：
注意事项：
1. 配制好的试剂一避光保存于 4℃，在一周内使用，若出现红色，则不能使用。
2. 试剂三易挥发，有毒，为了您的健康，请穿实验服，戴，戴乳胶手套操作。
附录I：标准曲线的制作
一、操作表：
标准管 S0 S1 S2 S3 S4
200μg/mL标准液（μL） 0 50 100 150 200
试剂二（μL） 200 200 200 200 200
甲醇（μL） 1800 1750 1700 1650 1600
避光反复震荡1小时，1mL光径玻璃比色皿，测定A485
相当于标准液浓度（μg/L） 0 5 10 15 20
注：标准液初始浓度为200μg/mL，因其为主要呈色物质，体系中的其他试剂只是对其起到了稀释作用，故终反应完反应液中标准浓度为（200μg/mL÷（各管反应体系总体积÷各管加入200μg/mL标准液体积））。
二、结果：
标准管号 S0 S1 S2 S3 S4
OD值 0.005 0.238 0.473 0.69 0.952
OD值 0 0.233 0.468 0.685 0.947
相当于标准液浓度（μg/L） 0 5 10 15 20
