组织蛋白激酶A（PKA）活性光度法定量检测试剂盒产品说明书

主要用途

组织蛋白激酶A（PKA）活性光度法定量检测试剂是一种旨在通过多肽底物受到PKA磷酸化后，进而由丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶连续循环法反应系统，测定产生ADP过程中，伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反应， 即采用光度法测定其氧化后峰值的变化，以分析组织裂解样品中PKA活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种组织裂解萃取液样品（动物、人体）、部分或*纯化酶样品中PKA激酶的定量检测，以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，高度敏感。

技术背景

蛋白激酶A（protein kinase A；PKA），又称cAMP依赖性蛋白激酶（cAMP dependent protein kinase），是第二信使依赖性酶。通过影响腺苷酸环化酶（adenylate cyclase；AC）和磷酸二酯酶（phosphodiesterase）的活性，而决定cAMP水平，达到调节PKA活性，进而调节细胞对于各种外部刺激的反应，包括细胞生长、代谢、DNA复制、细胞分裂、肌动蛋白细胞骨架重排等。该全酶（holoenzyme）具有两个催化亚体和两个调节亚体构成的四联体结构。cAMP结合调节亚体，而释放出活化的催化亚体，产生目标蛋白上丝/苏氨酸（serine/threonine）的磷酸化，诸如CREB、Histone H1、CREM、NF-κB和核受体等，而调控一系列细胞活动。其磷酸化目标序列为Arg-Arg-X-Ser/Thr或Lys-Arg-X-X- Ser/Thr。蛋白激酶A 至少有两个亚酶：I型亚酶存在于胞浆内，而二型亚酶与细胞膜、细胞器和细胞骨架相关。基于底物LRRASLG，在ATP的存在下，受到PKA激酶的磷酸化，获得产物磷酸化多肽，进而通过丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase；LDH）反应系统中，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其吸光峰值的变化（340nm），来定量分析蛋白激酶A的活性。其反应方式为：

PKA

LRRASLG  +  ATP  →  LRRApSLG  +  ADP

pyruvate kinase

Phosphoenolpyruvate  +  ADP       →      pyruvate  +  ATP

lactate dehydrogenase

pyruvate  +  NADH       →      lactate  +  NAD+

          （高吸收峰）（低吸收峰） 

产品内容

清理液（Reagent A）            60毫升

裂解液（Reagent B）            10毫升

缓冲液（Reagent C）            4毫升

酶促液（Reagent D）          500微升

反应液（Reagent E）          500微升

底物液（Reagent F）           500微升

阴性液（Reagent G）          500微升

产品说明书     1份

保存方式

保存清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，严格避免光照和反复冻融；有效保证6月

用户自备

PKA激酶：用于抑制剂筛选

1.5毫升离心管：用于样品保存的容器

15毫升锥形离心管：用于样品处理的容器

（微型）台式离心机：用于细胞预处理

200微升1厘米光径比色皿或96孔板：用于光度分析操作的容器

分光光度仪或酶标仪：用于样品光度分析

实验步骤

一、待测样品准备

1．手术取出动物组织，并秤重500毫克组织重量 

2．（选择步骤）放进预冷的15毫升锥形离心管

3．（选择步骤）加入3毫升清理液（Reagent A）清洗

4．（选择步骤）抽去清理液

5．移入到一个液氮冻存管

6．即刻放进液氮罐过夜

7．次日从液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎组织成粉末状（注意：切莫使组织冻融）

8．放进一个15毫升锥形离心管

9．加入置于冰槽里的100至500微升裂解液（Reagent B）（注意：可以调节蛋白浓度） 

10．强力涡旋震荡30秒，充分混匀

11．放进冰槽里孵育30分钟，期间每10分钟强力涡旋震荡30秒（注意：如需暂时停止，放进－70℃冰箱里储存备用）

12．即刻放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为10000g 

13．小心移取上清液到新的无菌的1.5毫升离心管

14．移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）

15．放进－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里备用

二、测定准备

1．准备好待测样品（例如组织裂解悬液等），置于冰槽里 

2．设定好分光光度仪（温度为30℃）：波长为340nm，间隔1分钟，读数6次（共5分钟），并置零

3．缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度

三、背景对照测定

1．移取130微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿

2．加入20微升酶促液（Reagent D）

3．加入20微升反应液（Reagent E）

4．加入20微升底物液（Reagent F）

5．放进30℃培养箱里静置3分钟

6．加入10微升阴性液（Reagent G）

7．上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）

8．即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照：340波长读数0分钟 －340波长读数5分钟

四、样品测定

1．移取130微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿

2．加入20微升酶促液（Reagent D）

3．加入20微升反应液（Reagent E）

4．加入20微升底物液（Reagent F）

5．放进30℃培养箱里静置3分钟

6．加入10微升待测样品（注意：50微克组织裂解蛋白；样品须溶解）

7．上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）

8．即刻放进分光光度仪检测，此为样品总活性读数：340波长读数0分钟 －340波长读数5分钟

五、计算样品活性

[（样品读数－背景读数）X 0.1（体系容量；毫升）X样品稀释倍数]÷[0.005（样品容量；毫升）X 6.22（毫摩尔吸光系数）X 5（反应时间；分钟）]＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克

单位＝微摩尔NADH/分钟

六、酶标板测定

1．在96孔板上做好相应标记：背景对照和样品

2．分别移取130微升缓冲液（Reagent C）到96孔板中

3．分别加入20微升酶促液（Reagent D）

4．分别加入20微升反应液（Reagent E）

5．分别加入20微升底物液（Reagent F）

6．轻轻摇动96孔板

7．在30℃温度下孵育3分钟

8．分别加入10微升阴性液（Reagent G）或待测样品（50微克组织裂解悬液蛋白）到相应孔中（注意：样品须清澈）

9．轻轻摇动96孔板

10．即刻放进酶标仪检测：0分钟读数和5分钟读数

11．活性计算：

[（样品读数－背景读数）X样品稀释倍数X 0.1（体系容量；毫升）]÷[0.005（样品容量；毫升）X 6.22（毫摩尔吸光系数）X 0.6（光径距离；厘米）X 5（反应时间；分钟）]＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克

单位＝微摩尔NADH/分钟

七、抑制剂筛选

1．在96孔板上做好相应标记：背景、*活性和待测抑制剂样品

2．按下表加入试剂，进行样品预处理

内容物空背景对照样本背景*酶活性待测抑制剂酶活性

缓冲液（Reagent C）20微升20微升20微升20微升

阴性液（Reagent G）20微升10微升10微升——

待测抑制剂——10微升――10微升

用户自备的纯化酶————10微升（1毫单位）10微升（1毫单位）

96孔板每孔总量空背景对照孔

（40微升）样本背景孔

（40微升）*活性孔

（40微升）待测抑制剂样品孔

（40微升）

轻轻摇动96孔板，混匀，放进30℃培养箱里孵育30分钟。然后进行下列操作

3．分别移取100微升缓冲液（Reagent C）到新的96孔板的所有孔里

4．分别加入20微升酶促液（Reagent D）

5．分别加入20微升反应液（Reagent E）

6．分别加入20微升底物液（Reagent F） 

7．轻轻摇动96孔板

8．在30℃温度下孵育3分钟

9．加入40微升上述预处理的待测样品

10．即刻放进30℃酶标仪检测：测读30分钟

11．抑制活性计算：

1)[（*活性读数－空背景对照读数）－（抑制剂样品活性读数－样本背景读数）]÷（*活性读数－空背景对照读数）＝实际抑制百分率

2)IC50：50％抑制率所需的抑制剂浓度

X（所需抑制剂样品浓度）＝（已知抑制剂样品浓度÷实际抑制百分率）X 50％

3）直接构建抑制曲线：纵座标（Y轴）为吸光单位（OD）；横座标（X轴）为已知抑制剂浓度

注意事项

1．本产品为25次操作，包括背景操作

2．操作时，须戴手套

3．系统操作过程中，背景测定只需1次

4．样品处理忌用磷酸缓冲溶液 

5．样品须澄清，至关重要 

6．建议使用比色皿测定

7．加入样品启动反应后3秒内即刻光度测定

8．测定值由高到低变化；测定可持续30分钟

9．光度测定后，比色皿须清洗*

10．样本测定0分钟读数高于5分钟读数表明具有酶活性

11．样本测定读数持续上升，表明酶活过低或样品量过低

12．建议待测样本蛋白浓度为50微克/10微升（本公司提供  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1） 

13．如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度

14．可以使用蛋白激酶A抑制剂（PKA-PKI）作为抑制剂对照或阴性对照

15．蛋白激酶A活性单位浓度定义：在30℃温度下，pH 7.5条件下，每分钟内能够氧化1微摩尔还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作为一个活性单位

16．本公司提供系列蛋白激酶检测试剂产品

质量标准

1．本产品经鉴定性能稳定

2．本产品经鉴定检测敏感