主要用途

组织氧化应激活性氧羟自由基比色法定量检测试剂是一种旨在通过捕获剂二甲基亚砜，受到羟自由基的氧化，进而与偶氮染料反应，产生黄色产物，由分光光度仪比色分析 ，来定量检测组织细胞内羟自由基活性氧族的生成和增加的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。适用于各种组织（动物、人体等）裂解悬液的羟自由基检测，以及羟自由基激发剂和抗氧化清除剂（scanvenger）等的检测。可以被用于细胞凋亡、信号传递、衰老、代谢和营养学等的研究。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，显色清晰。

技术背景

超氧自由基阴离子（superoxide radical；O2-）、过氧化氢（hydrogen peroxide；H2O2）、羟自由基或氢氧基（hydroxyl radical；OH-）、过氧化基（peroxyl radical；ROO-）、氢过氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO-）、过氧亚硝基阴离子（peroxynitrite anion；ONOO-）次氯酸（hypochlorous acid；HClO）、半醌自由基（semiquinone radical）、单线态氧气（singlet oxygen）等细胞内活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的产生和增多，将导致细胞衰老或凋亡。其中羟自由基或氢氧基具有极度反应性和毒性，同时半衰期短（10－9至10－10秒）。其产生主要是水分子受到高能量放射后裂解、过氧化物和次氯酸反应、过氧化氢的还原、超氧化物的歧化等形成。使用二甲基亚砜（dimethy sulfoxide；DMSO），作为羟自由基的分子探针，捕获羟自由基，并被氧化为甲基亚磺酸（methane sulfinic acid；MSA），在偶氮染料（diazonium dye）的作用下，产生黄色产物偶氮亚砜（diazosulfone），通过分光光度仪（325nm波长），检测未反应棕色成分，以测定羟自由基的含量。据此证明组织细胞内活性氧族的存在。其反应系统为：

            DMSO   +    OH      → MSA  +  CH3

                 MSA  +diazonium dye   →  diazosulfone +   H+

产品内容

清理液（Reagent A）    120毫升

标记液（Reagent B）    300微升

酸性液（Reagent C）    1毫升

染色液（Reagent D）    5瓶

净化液（Reagent E）                                    30毫升

终止液（Reagent F）    50毫升

萃取液（Reagent G）                                     30毫升

稳定液（Reagent H）         2.5毫升

标准液（Reagent I）     2毫升

产品说明书      1份

保存方式

保存染色液（Reagent D）和标准液（Reagent G）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；酸性液（Reagent C）和净化液（Reagent E）具有腐蚀性，注意操作安全；净化液（Reagent E）、萃取液（Reagent F）容易挥发，注意密闭；有效保证6月

用户自备

1.5毫升离心管：用于标准液配制的容器

2.2毫升离心管：用于样品操作的容器

5毫升玻璃管：用于样品操作的容器

15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器

DOUNCE匀浆器：用于组织细胞裂解

（微型）台式离心机：用于样品操作

1毫升1厘米光径石英或玻璃比色皿：用于比色分析的容器

分光光度仪：用于比色分析

实验步骤

一、样品准备 

• 手术取出动物组织，并秤重以确定500毫克组织重量 
• （选择步骤）放进预冷的15毫升锥形离心管
• （选择步骤）加入3毫升清理液（Reagent A）清洗1次
• 移入到一个液氮冻存管
• 即刻放进液氮罐过夜
• 次日从液氮罐里取出，即刻（zui快速度）用研磨棒碾碎组织成粉末状（注意：切莫使组织冻融）
• 放进一个15毫升锥形离心管
• 加入1毫升清理液（Reagent A）
• 强力涡旋震荡15秒
• 即刻放入预冷的DOUNCE匀浆器
• 在冰槽里用研磨棒匀化组织（约80下）
• 将所有组织匀浆物移入1.5毫升锥形离心管
• 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为10000g
• 小心移取3毫升上清液到新的预冷的1.5毫升锥形离心管
• 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－）
• 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

二、标准样品配制

• 准备好5个1.5毫升离心管，标记为1至5号管
• 分别加入450微升清理液（Reagent A）到2至5号管
• 移取900微升标准液（Reagent I）到1号管
• 小心移取450微升1号管的标准液（Reagent I）到2号管，混匀
• 小心移取450微升2号管稀释的标准液（Reagent I）到3号管，混匀
• 小心移取450微升3号管稀释的标准液（Reagent I）到4号管，混匀
• 将1至5号管放进冰槽里备用，避免光照；标准管浓度见下表

• 标准曲线测定

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的染色液（Reagent D）置入室温下，然后移出5毫升清理液（Reagent A）到染色液（Reagent D）瓶里，混匀后，加入5毫升净化液Reagent E），混匀后，移取5毫升上层液相到新的10毫升瓶里(注意使用PE或玻璃瓶），标记为染色工作液，使用锡箔纸包裹避光，置于冰槽里备用（注意：可以使用6次）。然后进行下列操作

标记为染色工作液，使用锡箔纸包裹避光，置于冰槽里备用（注意：可以使用6次）。 放在暗室里备用。然后进行下列操作

• 移取400微升上述配制的标准液（Reagent I）到2毫升离心管
• 加入40微升酸性液（Reagent C）
• 加入800微升染色工作液，手动混匀
• 室温下孵育10分钟，避免光照
• 加入1.2微升终止液（ReagentF），手动混匀
• 涡旋震荡1秒
• 静置分层
• 移取1毫升上层液相到新的2.2毫升离心管
• 加入1毫升萃取液（Reagent G），手动混匀
• 涡旋振荡1秒
• 静置分层
• 小心移取1毫升上层液相到新的比色皿
• 加入100毫升稳定液（Reagent H）
• 上下倾倒混匀
• 即刻放进分光光度仪（420nm波长）检测：获得吸光读数
• 重复实验步骤1至15四次
• 构建标准曲线：纵座标（Y轴）为吸光读数；横座标（X轴）为标准MSA浓度（微摩尔/升）