组织内蛋白氧化（羰基化；carbonyl）比色法测定试剂盒产品说明书（中文版）
主要用途
组织内蛋白氧化（羰基化；carbonyl）比色法测定试剂是一种旨在通过蛋白质羰基与联胺反应，
产生蛋白质腙复合物后峰值的变化，即采用比色法来测定样品中羰基含量的而经典的技术方法。该技
术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种组织裂解萃取液样品（动物、人体）样品蛋白质羰基的
含量检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。
技术背景
蛋白质氧化是由于活性氧直接诱导或氧化应激产物间接诱导产生蛋白质分子的共价修饰（covalent
modification），其中包括体外氧化剂，以及衰老、疾病所致。氧化还原循环中的阳离子，例如亚铁离子或铜
离子，可以与蛋白分子阳离子结合位点结合，一旦受到过氧化氢或氧分子的攻击，致使蛋白分子上脯氨酸
（proline）、精氨酸（arginine）、赖氨酸（lysine）、苏氨酸（threonine）、组氨酸（histidine）转化为羰基衍
生物（carbonyl derivatives）。羰基是由碳原子和氧原子双键构成的功能性基团。蛋白质羰基衍生物化学性能
稳定，其羰基化含量成为zui普遍的氧化应激活性氧的指标，更是蛋白质氧化的标志。基于蛋白质羰基与2,4-
联胺（2,4-dinitrophenylhydrazine；DNPH）反应，形成希夫碱，产生蛋白质腙复合物（proteinhydrazone），
在分光光度仪显示吸光峰值的变化（370nm波长），来定量测定羰基含量。其反应系统为：
Protein carbonyls + DNPH → protein- hydrazone
产品内容
清理液（Reagent A） 毫升
裂解液（Reagent B） 毫升
去干扰液（Reagent C） 毫升
反应液（Reagent D） 瓶
阴性液（Reagent E） 毫升
沉淀液（Reagent F） 毫升
净化液（Reagent G） 毫升
处理液（Reagent H） 毫升
产品说明书1 份
保存方式
保存去干扰液（Reagent C）和反应液（Reagent D）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；反应液（Reagent
D）避免光照；阴性液（Reagent E）、沉淀液（Reagent F）和处理液（Reagent H）具有腐蚀性，注意操作
安全；净化液（Reagent G）具有挥发性，注意密闭瓶盖；有效保证6 月
用户自备
1.5 毫升离心管：用于样品操作的容器
2 毫升离心管：用于样品反应的容器
15 毫升锥形离心管：用于样品操作的容器
DOUNCE 匀浆器：用于裂解组织
微型台式离心机：用于萃取反应产物
涡旋震荡仪：用于混匀反应
96 孔板：用于比色的容器
酶标仪：用于比色分析
实验步骤
一、样品准备
1． 手术取出动物组织，并秤重以确定200 毫克组织重量
2． （选择步骤）放进预冷的15 毫升锥形离心管
3． （选择步骤）加入xx 毫升清理液（Reagent A）清洗1 次
4． 移入到一个液氮冻存管
5． 即刻放进液氮罐过夜
6． 次日从液氮罐里取出，即刻（zui快速度）用研磨棒碾碎组织成粉末状（注意：切莫使组织冻融）
7． 放进一个15 毫升锥形离心管
8． 加入预冷的xx 毫升裂解液（Reagent B）
9． 强力涡旋震荡30 秒，充分混匀
10．放进DOUNCE 匀浆器里匀浆80 下
11．将匀浆液转移到1.5 毫升离心管
12．放进4℃微型台式离心机离心15 分钟，速度为10000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
13．小心移取800 微升上清液到新的预冷的1.5 毫升离心管
14．加入xx 微升去干扰液（Reagent C），混匀
15．室温下孵育15 分钟
16．放进4℃微型台式离心机离心10 分钟，速度为6000g
17．小心移取上清液到新的1.5 毫升离心管
18．移取10 微升进行蛋白定量检测
19．即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作（注意：建议在1 月之内完成检测）
二、样品检测
实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的反应液（Reagent D）取出，加入xx 毫升阴性液（Reagent E），
混匀，标记为反应工作液，置入冰槽里备用，避免光照。然后进行下列操作。
1． 准备好待测样品（例如组织裂解萃取液样品等），置于冰槽里
2． 设定好分光光度仪：波长370nm，并置零
3． 准备2 个2 毫升离心管，标记为背景管和样品管
4． 分别移取200 微升待测样品到背景管和样品管
5． 加入xx 微升反应工作液到样品管
6． 加入xx 微升阴性液（Reagent E）到背景管
7． 分别涡旋震荡15 秒
8． 室温下孵育60 分钟，每隔15 分钟涡旋震荡15 秒，避免光照
9． 分别加入xx 毫升沉淀液（Reagent F）
10．分别涡旋震荡15 秒
11．置于冰槽里孵育5 分钟
12．放进微型台式离心机离心15 分钟，速度为10000g（或10000RPM，例如eppendorf 5415）
13．分别小心抽去上清液
14．分别加入xx 毫升净化液（Reagent G）
15．分别涡旋震荡15 秒
16．放进微型台式离心机离心10 分钟，速度为10000g（或10000RPM，例如eppendorf 5415）
17．分别小心抽去上清液
18．分别加入xx 微升处理液（Reagent H）
19．分别涡旋震荡15 秒
20．放进微型台式离心机离心10 分钟，速度为10000g（或10000RPM，例如eppendorf 5415）
21．分别移取250 微升上清液到96 孔板里的测试孔
22．即刻放进酶标仪检测：获得背景读数和样品读数
23．实际吸光读数：样品管读数－背景管读数
24．计算样品含量：
注意事项
1． 本产品为20 次操作
2． 操作时，须戴手套
3． 阴性液（Reagent E）、沉淀液（Reagent F）和处理液（Reagent H）具有腐蚀性，注意操作安全
4． 净化液（Reagent G）具有挥发性，注意密闭瓶盖
5． 每次检测，需进行样品背景测定
6． 反应工作液配制后，可以在4℃保存，但需在1 周内用完；避免-20℃保存
7． 如果酶活性过低，可以增加反应时间至2 小时
8． 建议待测样本蛋白浓度为1 至10 毫克/毫升
9． 本公司提供系列氧化检测试剂产品
质量标准
1． 本产品经鉴定性能稳定
2． 本产品经鉴定检测敏感