植物L苯*解氨酶（PAL）酶联免疫分析（ELISA）试剂盒说明书

本试剂仅供研究使用       目的：本试剂盒用于测定植物组织，细胞及其它相关样本中植物L苯*解氨酶（PAL）活性。

实验原理：

   本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中植物L苯*解氨酶（PAL）水平。用纯化的植物L苯*解氨酶（PAL）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入植物L苯*解氨酶（PAL），再与HRP标记的L苯*解氨酶（PAL）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过*洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的L苯*解氨酶（PAL）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中植物L苯*解氨酶（PAL）浓度。

试剂盒组成：

标本要求：

1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融

2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

操作步骤：

1.         标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在*、第二孔中分别加标准品100μl，然后在*、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从*孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为360 U/L，240 U/L，120 U/L，60 U/L ，30 U/L）。

2.         加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品zui终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3.         温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

4.         配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。

5.         洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

6.         加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

7.         温育：操作同3。

8.         洗涤：操作同5。

9.         显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.

10.     终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

11.     测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。