大鼠肿瘤坏死因子α（TNF-α）酶联免疫检测
试剂盒使用说明书
使用前仔细阅读本说明书。本酶联免疫试剂盒是基于双抗体夹心技术原理，来检测大鼠肿
瘤坏死因子α（TNF-α），只能用于研究用途，不得用于医学诊断。
用途：用于大鼠血清、血浆、组织及相关液体样本中肿瘤坏死因子α（TNF-α）的测定。
工作原理
本试剂盒采用的是双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）测定样品中大鼠肿瘤坏死因
子α（TNF-α）的水平。向预先包被大鼠肿瘤坏死因子α（TNF-α）抗体的酶标孔中加入肿
瘤坏死因子α（TNF-α），温育；洗涤后，加入HRP 标记的肿瘤坏死因子α（TNF-α）抗体。
再经过温育和洗涤，去除未结合的酶，然后加入底物A、B，产生蓝色，并在酸的作用下
转化成zui终的黄色。颜色的深浅与样品中大鼠肿瘤坏死因子α（TNF-α）的浓度呈正相关。
试剂盒组成
1 标准品0.3ml*6 管7 显色剂B 液6ml
2 酶标包被板12 孔×8 条8 终止液6ml
3 酶标试剂6ml 9 说明书1 份
4 20 倍浓缩洗涤液25ml 10 封板膜2 张
5 样品稀释液6ml 11 密封袋1 个
6 显色剂A 液6ml
注：标准品（S1-S6）的浓度依次为：0、10、20、40、80、160 pg/mL
需要而未提供的试剂和器材
1． 37℃恒温箱。
2． 标准规格酶标仪。
3． 精密移液器及一次性吸头
4． 蒸馏水，
5． 一次性试管
6． 吸水纸
注意事项
1． 从2-8℃取出的试剂盒，在开启试剂盒之前要室温平衡至少30 分钟。酶标包被板开封
后如未用完，板条应装入密封袋中保存。
2． 各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差
3． 建议所有标准品、样本都做双份检测。
4． 严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.
5． 为避免交叉污染，要避免重复使用手中的吸头和封板膜。
6． 不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。
7． 底物B 对光敏感，避免长时间暴露于光下。
洗板方法
手工洗板方法：甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几
次；将稀释后的洗涤液至少0.35ml 注入孔内，浸泡1-2 分钟。根据需要，重复此过程数次。
自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中
标本要求
1．不能检测含NaN3 的样品，因NaN3 抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
2．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能
马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融
操作程序
1． 分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准品孔、待
测样品孔。在酶标包被板上标准品孔中加入标准品50μl；在酶标包被板上待测样品孔
中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品zui终稀释度为5 倍）。每孔加
入酶标试剂50μl，空白孔除外。轻轻晃动混匀，37℃温育60 分钟。
2． 弃去液体，甩干，每孔加满稀释后洗涤液，振荡30 秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。
如此重复5 次，拍干。
3． 每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15 分
钟.
4． 取出酶标板，每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
5． 测定：以空白孔调零，在450nm 波长下测量各孔的吸光度值（OD 值）。测定应在加
终止液后15 分钟以内进行。
6． 根据标准品的浓度及对应的OD 值计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样品的OD
值在回归方程上计算出对应的样品浓度。也可以使用各种应用软件来计算。应记住由
于样品稀释了的，其实际浓度应该乘以总稀释倍数。
操作程序总结：
准备试剂，样品和标准品
加入准备好的样品、标准品和酶标试剂，37℃反应60分钟
洗板5次，加入显色液A、B，37℃显色15分钟
加入终止液
15分钟之内读OD值
计算
检测范围：5pg/mL→160pg/mL。
规格： 96T/盒
保存： 2-8℃
有效期： 6 个月（2-8℃）。

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