实验目的

1.  掌握IL-2生物学活性测定的原理。
　　2.  熟悉IL-2生物学活性测定的实验方法和结果计算。

实验原理

IL-2是由Th细胞产生的淋巴因子，在淋巴细胞增殖分化过程中起到非常重要的作用。IL-2活性测定基于IL-2能维持IL-2依赖细胞的代谢和存活，促进这类细胞的增殖。细胞在增殖时能量代谢活跃，可产生大量的能量以供合成多种大分子物质和细胞分裂所需，能量代谢的水平与细胞合成DNA水平基本平行，因此，测定细胞能量代谢的水平可以间接地反映细胞增殖情况。

MTT（四甲基偶氮唑盐）是一种淡黄色的水溶性化合物，活细胞（特别是增殖期的细胞）通过线粒体能量代谢过程中的琥珀酸脱氢酶的作用，使淡黄色的MTT分解产生蓝色结晶状甲臢沉积于细胞内或细胞周围，且形成甲臢的量与细胞增殖程度呈正比，甲臢经SDS作用后可溶解显色。溶解液的光密度值与细胞代谢及IL-2活性正相关。

实验材料

1.  1640培养液（*）、IL-2标准品、待测IL-2样品、CTLL-2细胞株、MTT溶液（5mg/ml）、10%SDS
　　2.  96孔细胞培养板、多头细胞收集器、微量加样器、CO2孵箱、酶标仪

实验方法

1.  制备CTLL-2细胞悬液  取生长旺盛的CTLL-2细胞，用1640培养液将细胞洗3次，用*1640培养液配成2×105/ml细胞悬液。
　　2.  稀释样品和标准品  将待测样品和标准IL-2用*1640培养液做一定的倍比稀释。
　　3.  加样与检测  向96孔细胞培养板内加入不同稀释度的样品和标准品（50μl/孔），每稀释度3个复孔，并设细胞对照。再向各孔加入50μl细胞悬液，混匀，置5%CO237℃培养36小时，每孔加入MTT溶液20μl CO2孵育6～8小时后，每孔再加10%SDS100μl，充分混匀，37℃孵箱静放（使甲臢全溶解）。在酶联仪上选波长570nm测定OD值，将待测样品的OD值与标准品OD值比较后，求得待测样品的IL-2活性单位。

结果计算

将各稀释度的OD值按照样品zui大增殖OD值的百分比换算成概率单位，可将原来呈S形的曲线转换成为直线。根据这些点的数据求出各直线的回归方程。再从回归方程求出各样品达50%zui大增殖时的稀释度，然后按公式求出待测样品IL-2的活性单位。

注意事项

1.  MTT液要现配现用，避免光照，若有蓝色颗粒需过滤后再用。
　　2.  生物学测定法敏感性高，特异性强，所测IL-2是具有生物活性的IL-2，而不象免疫学测定法所测定免疫反应性IL-2蛋白，因此测定的条件和要求要严格按规程。
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