研究目的

转录组是指在一个生物体中所有基因表达后产物的总和，是功能基因组研究的一个重要功能指标。基于新一代测序的动植物转录组学研究可以在RNA水平研究动植物性状、组织特异性的生理学过程，了解动植物的发育过程中的分子机制以及对外界环境的适应和进化的机制，并为动植物疾病预防或遗传育种的分子标记开发提供理论依据。

研究对象

动植物不同发育阶段、不同物种或相同物种的不同组织器官、不同外界环境刺激或不同生理状况的动植物的转录组差异检测与分析。

新一代测序方案
lncRNA-seq（ 长非编码RNA 测序）

长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一类不编码蛋白的RNA分子，长度在200nt以上，起初被认为是RNA聚合酶II转录的副产物，不具有生物学功能。zui近几年的研究表明lncRNA具有保守的二级结构，可以与蛋白质、DNA和RNA相互作用，参与多种生物学过程的调控，如染色质修饰、转录激活和抑制、转录后调控以及作为miRNA的诱导分子干扰基因的表达等， 因此lncRNA是一片非常广阔的未知领域，具有*的研究价值和意义。通过rRNA去除的方法，富集lncRNA和mRNA建库测序，可分析lncRNA和mRNA的表达情况，并发现大量新lncRNA及mRNA。
*数据量：10G
polyA-seq （mRNA测序）

通过polyA尾抓取mRNA建库测序，检测mRNA的差异表达或结构变异，筛选与疾病或性状相关的分子标记。转录组测序可揭示转录组的复杂性，确定基因以及转录本结构、可变剪接、RNA编辑、带polyA尾的非编码RNA和新转录本。
*数据量：5G
基因表达谱测序(升级版DGE)

采用转录组测序（RNA-seq）建库，直接对某一物种或特定细胞在特定功能状态下产生的mRNA进行高通量测序的方法，已被广泛应用于基础科学研究、疾病机理、生物标记和药物研发等领域。相对而言DGE更适合用于比较基因表达，无偏性，对于细胞生物的转录表达谱更为敏感和准确。RNA-seq和DGE两种方法结合，对于无参考基因组或基因组较大且复杂的物种，可以有效地发掘新的功能基因。
*数据量：10M reads
Small RNA-seq （小RNA测序）

Small RNA是生物体内一类重要的非编码小分子RNA，长度20-30个核苷酸，主要包含miRNA、 piRNA、siRNA、snoRNA等RNA分子。Small RNA参与基因表达与调控、RNA的加工与剪切、蛋白质翻译、遗传“入侵”抑制、配子发生等生物学过程。

微小RNA(microRNA, 简称miRNA)，是small RNA中的主要成分, 在进化上高度保守, 可通过识别靶mRNA 实现

转录后的基因调控。piRNA(PIWI-interacting RNA)是一类新型的非编码小分子RNA，与PIWI蛋白相互作用，长度约26～32个核苷酸，其作用与Dicer酶无关。piRNA在生殖细胞的发育、转座子沉默、减数分裂和精子发生等过程中具有多种生物学功能，另外piRNA还能通过调控编码蛋白基因的甲基化修饰影响神经细胞的记忆功能。如果piRNA研究趋势与microRNAs相似的话，那么可以预见piRNA无疑将一轮新的研究热潮。
*数据量：10M reads

案例解读

转录组测序研究胚胎发育过程lncRNA的作用(Andrea Pauli et al., Genome Research. 2012)

背景：lncRNA是指长度超过200个核苷酸的非编码RNA。lncRNA能够与修饰组蛋白的蛋白复合体相互作用并影响其活性，从而控制基因的活化状态（可激活、激活或抑制），是胚胎发育过程*的调节子。本文系统报道了脊椎动物胚胎的lncRNA表达图谱，为以后的遗传学、基因组学和进化研究提供了基础。

选材：研究者以野生型斑马鱼胚胎为研究对象，在受精后的不同时期（0.75h、3h、4.5h、6h、10h、28h、48h和120h）分别收集1000个胚胎（见图2），为了消除差异，样品在10分钟之内完成收集。

    选材：研究者以野生型斑马鱼胚胎为研究对象，在受精后的不同时期（0.75h、3h、4.5h、6h、10h、28h、48h和120h）分别收集1000个胚胎（见图2），为了消除差异，样品在10分钟之内完成收集。测序方法：采用polyA尾富集的方法进行RNA测序，平均测序数据量为200-300M reads，鉴定了胚胎发育过程中相关的lncRNA和mRNA。

结果：获得斑马鱼不同发育时间点的lncRNA表达图谱

1. 斑马鱼不同时间点的发育图谱

图2. 斑马鱼发育取样时期。

2. 斑马鱼lncRNA功能分析

对鉴定的835个lncRNA基因座和mRNA进行共表达分析，共表达结果进行GO分析，zui重要的10个GO中，主要与信号通路（簇2）、发育（簇6）和细胞周期（簇8）相关，簇4-7几乎都与发育功能相关，说明胚胎中的lncRNA可能发挥发育调控的作用，见图3。对几个重要的lncRNA进行原位杂交验证，发现不同的lncRNA在不同的发育时期的表达情况，在二细胞期、肌肉和神经组织中都有特异性表达，见图4。

图3. lncRNA与mRNA共表达分析，行表示lncRNA，列表是功能基因，红色表示正相关，蓝色表示负相关，白色表示不相关。

图4. lncRNA组织特异性原位杂交，对GO分析中重要的lncRNA进行原位杂交，显示相应lncRNA在二细胞期、肌肉和神经组织的特异性表达。