【摘要】  　　目的: 制备抗人骨桥蛋白（hOPN）的单克隆抗体（mAb）, 用于其功能研究。方法: 构建OPN的原核表达载体pTriEx1hONP载体, 转化Tuner(DE3)placI 感受态大肠杆菌, 用IPTG进行诱导表达。利用镍柱亲和层析纯化OPN蛋白, 纯化蛋白经超滤浓缩洗涤后即为免疫原。以重组纯化的OPN蛋白为免疫原, 免疫BALB/c小鼠, 取免疫小鼠的脾细胞和同系小鼠的骨髓瘤细胞Sp2/0进行常规融合, 通过有限稀释法进行克隆和间接ELISA筛选, 获得分泌鼠抗人OPN蛋白mAb的杂交瘤细胞株, 通过ELISA、 Western blot等方法检测其特异性, 并用免疫组化方法检测了正常月经周期子宫内膜OPN的表达。结果: pTriEx1hONP表达的OPN蛋白主要为可溶性形式, 经镍柱纯化后, 蛋白纯度可达85％以上。纯化的OPN重组蛋白免疫小鼠后经融合筛选, 得到2株稳定分泌抗人OPN的mAb杂交瘤细胞株, 分别命名为1E7和5B7, 两株mAb的免疫球蛋白亚类分别IgG1和IgG2a。通过ELISA和Western blot等方法鉴定, 抗OPN的mAb能与OPN蛋白特异性结合。通过免疫组织化学方法对不同时期的正常子宫内膜的OPN的检测表明, 子宫内膜腺上皮在增生期、 分泌早期, OPN呈 弱阳性表达; 分泌中、 晚期OPN呈强阳性表达。结论: 以纯化的重组hOPN为免疫原成功制备了鼠抗hOPN的mAb, 并初步进行了应用, 为研究hOPN的功能打下了良好基础。

【关键词】  骨桥蛋白; 原核表达; 单克隆抗体

　　骨桥蛋白（osteopontin, OPN）是一种机体反应性的多功能磷酸化糖蛋白, 具有**天冬氨酸（arginineglycineaspartic acid, RGD）序列, 可通过该序列与整合素和CD44结合, 参与细胞的黏附、 迁移等［1］。OPN功能复杂多样, 与免疫系统、 肿瘤转移、 消化系统、 泌尿系统、 生殖系统、 骨组织等关系密切, 参与疾病的发生［2, 3］。近年来有学者发现子宫内膜、 蜕膜等生殖系统也表达OPN, OPN在胚胎的着床、 生长发育及分化等方面也起着重要作用, 因此OPN在生殖系统疾病中的作用值得近一步研究［4］。我们通过构建OPN的原核表达载体, 表达纯化OPN蛋白并制备小鼠抗人OPN蛋白单克隆抗体(mAb）, 用于OPN的检测, 以进一步研究OPN与生殖疾病的关系。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料  克隆用大肠杆菌DH5α本室保存。表达质粒pTriEx1、 含人OPN cDNA的质粒pET28ahOPN及表达用大肠杆菌Tuner（DE3）placI由哈佛大学刘思金博士惠赠。6～8周龄的BALB/c小鼠（雌性）,  购自中国医学*动物所。

　　1.2  方法

　　1.2.1  表达载体的构建  根据OPN基因序列NCBI（Accession Number:  NM_000582）设计一对扩增引物扩增人OPN基因编码序列全长: PCR上游引物P1为5′CGGGAGCTCCCAGATGCTGTGGCCACATG3′,  引入Sac I酶切位点, 下游引物P2为5′GTGCTCGAGATTGACCTCAGAAGATGCAC3′引入Xho I 酶切位点。扩增部分为 hOPNcDNA序列（Accession Number:  NM_000582）的2741065位核苷酸。以pET28ahOPN为模板进行PCR扩增。PCR反应条件为94℃预变性 3 min, 然后94℃ 45 s, 55℃ 45 s, 72℃  1 min 循环, 共30个循环, zui后72℃延伸10 min, PCR产物用凝胶回收试剂盒回收后和pTriEx1均以Sac I和Xho I酶切并纯化, 二者用T4 DNA连接酶16℃连接过夜, 转化大肠杆菌DH5α, 将菌液涂布于含100 mg/L氨卞*的LB平板, 筛选阳性克隆并进一步用PCR和测序进行鉴定。

　　1.2.2  OPN蛋白的诱导表达和纯化  挑取鉴定正确的pTriEx1hONP质粒转化大肠杆菌Tuner（DE3）placI, 挑取单个阳性克隆接种于含有5 mL  LB培养基（含氨苄*100 mg/L, 10 g/L的葡萄糖）中, 37℃ 250 r/min 摇菌至A值达0.5左右时, 加入浓度为1 mmol/L的IPTG, 诱导3 h后离心收集菌体, 同时在诱导前取样作为对照。收集的菌体经超声裂解后取上清和沉淀分别进行SDSPAGE电泳, 考马斯亮兰染色分析。按上述方法对pTriEx1hONP进行大量诱导表达蛋白, 取出培养物5 000 r/min离心收集细胞, 超声破碎细胞, 镍离子金属鳌合柱（NiNTA）纯化目的蛋白, 收集洗脱液, 经SDSPAGE鉴定后超滤管超滤浓缩洗涤后备用。

　　1.2.3  鼠抗人OPN mAb的制备  纯化后的OPN抗原与等体积的*弗氏佐剂混合, 充分搅拌直至成为油包水, 腹部皮下多点注射。每只小鼠注射20 μg抗原, 共注射5只小鼠。2周后同剂量抗原加福氏不*佐剂加强免疫, 加强免疫2次。后一次加强免疫7 d后以间接ELISA检测小鼠血清抗人OPN多抗的效价, 效价高者尾静脉再冲击免疫1 次, 每只20 μg, 3 d后进行细胞融合。将免疫小鼠的脾细胞悬液与体外培养的Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞以5∶1的比例在聚乙二醇作用下按常规法融合, 采用有限稀释法对杂交瘤细胞进行克隆化培养。以重组纯化的人OPN蛋白作为抗原（0.4 mg/L）包被酶标96孔板, 间接ELISA法检测杂交瘤细胞培养上清, 所测的A490比阴性对照高10倍的克隆, 进行亚克隆化, 并进行扩增冻存。经过3次有限稀释克隆化, 将分泌特异性抗体的杂交瘤细胞系大量扩增并冻存, 长期传代培养后, 以相同的方法再次克隆化鉴定之。

　　1.2.4  mAb生物学特性的分析和鉴定  （1）mAb的Ig亚类鉴定: 取杂交瘤细胞培养上清液, 用Roch公司提供的IsoStripTM鼠mAb亚类检测试剂盒进行IgG亚类鉴定。具体操作过程按照说明书进行。（2）应用Western blot测定mAb的特异性。将纯化的重组人OPN和pTriEx1hONP转化Tuner（DE3）placI诱导后的菌体蛋白进行SDSPAGE电泳, 电转至PVDF膜上, 用50 g/L脱脂奶粉4℃封闭过夜, 加入抗人OPN mAb, 室温反应1 h , TBST（0.1 mol/L Tris.Cl, pH7.5,  0.5 mL/L Tween20）缓冲液洗膜3次, 加入羊抗鼠IgGHRP抗体（1∶10 000稀释）, 室温下孵育1 h, TBST洗涤3次。ECL法显色。（3）mAb效价的检测: 常规方法诱生小鼠mAb腹水, 离心取上清分装, 冻存于-70℃。应用Protein G免疫亲和层析法纯化mAb, 方法按Pharmaeia公司方法进行。以纯化OPN 10 mg/L包被酶标板, 常规间接ELISA方法检测纯化血清效价。（4）相加实验: 取上述包被好的抗原酶标孔, 取2株阳性单克隆孔的细胞培养上清为一抗, 进行间接ELISA反应, 测定反应显色后的A490值, 按公式计算它们的相加系数: AI=［2A1+2/(A1+A2)-1］×100%, 其中A1+2为相加孔吸光值, A1、 A2为非相加孔的吸光值。AI接近100%, 则2个mAb识别不同的抗原表位, AI接近0, 则2个mAb识别相同的抗原表位。

　　1.2.5  免疫组织化学方法检测子宫内膜OPN的表达  正常人子宫内膜经常规方法固定、 包埋、 切片、 脱蜡、 至水后, PBS洗3次,  30 mL/L H2O2甲醇溶液室温孵育10 min, PBS洗涤后微波抗原修复, PBS洗涤后加100 mL/L的山羊血清37℃封闭20 min, 加入杂交瘤培养上清, 4℃孵育过夜, PBS洗片后加入羊抗鼠IgGHRP, 37℃孵育30 min, PBS洗片后进行DAB显色, 苏木素复染, 返蓝后封片。

　　2  结果

　　2.1  重组质粒pTriEx1hOPN的构建和鉴定  以pET28ahOPN为模板, 扩增人OPN的全长791 bp, 与预期结果相符（图1）。将hOPN亚克隆到原核表达载体pTriEx1多克隆位点中（Sac I和Xho I）。重组克隆经酶切及PCR鉴定, 目的片段大小与预期相符（图2）。测序结果显示目标序列与NCBI（Accession Number:  NM_000582）相应序列相符, 证实表达载体pTriEx1hOPN构建成功。

　　2.2  hOPN融合蛋白的诱导表达及纯化  pTriEx1hOPN阳性菌株经IPTG诱导后SDSPAGE电泳显示: 在37℃、 1 mmol/L IPTG诱导3 h条件下, 融合蛋白表达达到高峰, 蛋白条带位于Mr约55 000处（比计算的Mr大）。该重组蛋白主要以可溶性形式存在, 用镍离子金属鳌合柱（NiNTA）层析柱纯化后, 蛋白浓度证实纯度在85%以上(图3)。

　　图1  OPN PCR扩增产物（略）

　　1: DNA marker DL 2000; 2: PCR扩增的人OPN片段.

　　图2  pTriEx1hONP酶切鉴定（略）

　　1: DNA marker(λDNA/Hind III+EcoR I); 2:  Sac I和Xho I双酶切重组质粒pTriEx1hOPN.

　　图3  重组蛋白的SDSPAGE分析（略）

　　M: 蛋白质marker;  1, 2:  pTriEx1转化Tuner（DE3）placI诱导前的上清和沉淀; 3, 4:  pTriEx1转化Tuner（DE3）placI诱导后的上清和沉淀; 5, 6:  pTriEx1hOPN转化Tuner（DE3）placI诱导前的上清和沉淀; 7, 8:  pTriEx1hOPN转化Tuner（DE3）placI诱导前的上清和沉淀; 9: 纯化的OPN蛋白.

　　2.3  特异性分泌鼠抗人OPN mAb的杂交瘤细胞株的建立  按常规方法以重组人OPN蛋白为免疫小鼠后进行细胞融合, 将融合10块96孔培养板, 融合率约为85％。将复测为阳性的克隆连续3次克隆化培养, 获得2株持续分泌特异性抗人OPN mAb的杂交瘤细胞株, 分别命名为1E7和5B7。杂交瘤细胞株经体外连续传代培养, 液氮冻存半年后复苏, 仍生长良好, 分泌抗体性能稳定。

　　2.4  mAb的特性分析及鉴定  1E7和5B7 mAb的免疫球蛋白亚类分别IgG1和IgG2a, 二者轻链均为κ型。经Western blot证实2株抗体均可特异性结合表达的OPN蛋白（图4）。用间接ELISA检测该2株抗体的效价为1∶10 000以上。相加实验测得mAb细胞株1E7和5B7培养上清的相加系数接近于100%, 说明2个mAb可识别OPN的不同抗原表位。

　　2.5  OPN在正常人子宫内膜的表达  免疫组化显示在子宫内膜腺上皮的增生期和分泌早期, 骨桥蛋白呈弱阳性表达（图、 B）, 分泌中期和分泌晚期骨桥蛋白在腺上皮腔面, 皆呈中等强度和强阳性表达（图5C、  D）, 血管内皮细胞呈弱阳性表达, 整个月经周期中子宫内膜间质细胞不表达骨桥蛋白。在同一标本中各腺体及腺细胞染色不均匀, 但阳性细胞数均在50%以上。

　　图4  OPN mAb的Western blot 鉴定（略）

　　1: pTriEx1hOPN转化Tuner（DE3）placI后的诱导上清;  2: 纯化的 OPN蛋白.

　　图5  OPN在正常月经周期子宫内膜中的表达（免疫组化, ×100）（略）

　　A: 增殖期子宫内膜; B: 分泌早期子宫内膜; C: 分泌中期子宫内膜; D: 分泌晚期子宫内膜.

　　3  讨论
    　　
　　近年来OPN表达与生殖的关系逐渐受到人们的重视, 但对OPN在子宫内膜中表达的具体作用知之甚少。OPN作为一种细胞外基质蛋白, 通过在细胞－细胞间, 细胞与ECM间的相互作用中起着重要作用, 几乎参与了生殖的全过程: 受精, 着床及胎盘的形成, 并在胎盘和子宫的连接、 信号转导中具有重要作用［5］。OPN表达过量或不足均可能引起疾病, 如不明原因的不孕, 或子宫内膜异位症等。zui近有报道称子宫内膜异位证患者的在位内膜及异位内膜均较正常人子宫内膜OPN表达水平高。OPN可能在子宫内膜的侵袭、 转移中起了重要作用, 也可能由于子宫内膜高表达OPN, 使机体对OPN的免疫应答状态发生了变化。我们用构建的pTriEx1hOPN转化大肠杆菌Tuner（DE3）placI后成功表达出OPN蛋白, 我们所表达的重组OPN蛋白在SDSPAGE电泳中表现Mr为55 000, 大于其计算Mr（33 000）。OPN的这种异常电泳行为与Helluint等［6］的报道一致。我们经免疫融合筛选后获得2株抗人OPN特异性mAb, 用间接ELISA方法测得其纯化腹水效价均在1∶10 000以上, 且为识别OPN不同抗原表位的mAb, 可能用于双抗体夹心法测定OPN的水平。通过免疫组织化学方法对不同时期的正常子宫内膜的OPN的检测表明, 子宫内膜腺上皮在增生期、 分泌早期, OPN呈弱阳性表达; 分泌中、 晚期OPN呈强阳性表达, 与有关报道一致［7］。抗人OPN mAb的成功制备不但具有良好的临床应用前景, 也为我们进一步研究OPN表达与生殖疾病的关系打下了良好基础。

【参考文献】
  　　［1］ Khan SA, Cook AC, Kappil M, et al. Enhanced cell surface CD44 variant(v6, v9)expression by osteopontin in breast cancer epithelial cells facilitates tumor cell migration: Novel post transcriptional, post translational regulation［J］. Clin Exp Metastasis, 2005, 22(8): 663-673.

　　［2］ Rittling SR, Chambers AF. Role of osteopontin in tumor progression［J］. Br J Cancer, 2004, 90(10): 1877-1881.

　　［3］ Kim JH, Skates SJ, Uede T, et al. Osteopontin as a potential diagnostic biomarker for ovarian cancer［J］.JAMA, 2002, 287(13): 1671-1679.

　　［4］ White FJ, Ross JW, Joyce MM, et al. Steroid regulation of cell specific secreted phosphoprotein 1(osteopontin)expression in the pregnant porcine uterus［J］. Biol Reprod, 2005, 73(6): 1294-1301．

　　［5］ Weintraub AS, Lin X, Itskovich VV, et al. Prenatal detection of embryo resorption in osteopontin deficient mice using serial noninvasive magnetic respane microscopy［J］. Pediatr Res, 2004, 55(3): 419-424.

　　［6］ Helluint O, Chan C, Vilaire G, et al. The activation state of αvβ3 regulates plaet and lymphocyte adhesion to intact and thrombin cleaved osteopontin［J］. J Biol Chem, 2000, 275(24): 18337-18343．