实验材料
已纯化好的Double-Stranded cDNA。
实验步骤
1. 体外转录合成*标记cRNA
使用Affmetrix IVT Labeling Kit，按操作说明进行:
1) 取0.2 ml EP管，加入纯化后12ul Double-Stranded cDNA。
2) 室温下，按照表1依次加入下列组分，轻弹管壁使其充分混匀，瞬时离心(约5 sec)收集溶液于管底。
3) 37℃温育16h，之后进行下一步。
2. *标记cRNA纯化、定量和检测
1) cRNA纯化
a. 加60ul RNase-free Water到IVT反应体系中，漩涡3 sec混匀。
b. 加350 ul IVT cRNA Binding Buffer到样品中，漩涡3 sec混匀。
c. 加250ul无水乙醇到混合物中，移液器吹打充分混匀。
d. 将700 ul混合液转移到IVT cRNA Cleanup Spin Column(置于2ml Collection Tube内)中，大于等于8000 g离心15 sec，弃滤液和Collection Tube。
e. 将Spin Column转移至新的2 ml Collection Tube中，加500 ul IVTcRNA Wash Buffer到Spin Column中，大于等于8000 g离心15 sec，弃滤液。
f. 加500 ul80%乙醇到Spin Column中，大于等于8000 g离心15 sec，弃滤液。
g. 打开Spin Column的管盖，zui大转速(小于等于25000 g)离心5 min，弃滤液和Collection Tube。
h. 将Spin Column转移到新的1.5 ml Collection Tube中，将11 ul RNase-free Water直接加到Spin Column的膜上，zui大速(小于等于25000 g)离心1 min洗脱。
i. 再加10ul RNase-free Water于Spin Column的膜上，zui大速(小于等于25000 g)离心1 min洗脱。
j. 进行cRNA定量，如果不马上定量，则-70℃保存。
2) cRNA定量
a. 按1:100倍稀释，即2ul cRNA 198ul Nuclease-free Water，用紫外分光光度法测定cRNA的浓度以及A260/A280。
b. 计算测量cRNA产量。
cRNA测量产量(ug)=cRNA浓度(ug/ul) X稀释倍数X cRNA洗脱体积
c. 计算实际cRNA产量
实际cRNA产量=测量cRNA产量一起始总RNA用量/用于体外转录cDNA的比例
3) 电泳检测
1.2%甲醛变性胶电泳检测cRNA片段分布范围。
3. *标记cRNA的片段化及检测
使用Affymetrix Sample Cleanup Module，按操作说明进行:
1) 按照表2制备片段化反应体系，轻弹管壁数次使其充分混匀，瞬时离心(约5 sec)收集溶液于管底。
2) 94oC温育35 min，之后立即置于冰上。
3) 取2 ml片段化产物，用甲醛变性胶电泳检测cRNA大小分布范围，标准的片段化程序将会产生大小分布在35-200 nt的片段化cRNA。
4) 进行下一步或于-70oC贮存。
