喹诺酮（QNS）定量检测试剂盒（ELISA）
使用说明书
一、概要
喹诺酮（QNS）是近20年来迅速发展起来的一类十分重要的广谱抗生素，能抑制细菌DNA螺旋酶，抗菌谱广、、低毒、组织穿透力强。已成为兽医临诊和水产养殖中zui重要的抗感染药物之一，被大量用于治疗、预防和促生长，由于其耐药性和潜在的致癌性引起广泛的关注。
酶联免疫快速检测试剂盒具有成本低廉、操作简便、一次处理样本量大等优点，已成为常规的初步筛查方法。本试剂盒是应用ELISA技术研发的新一代药物残留检测产品，与仪器分析技术相比具有快速、简便、准确和灵敏度高等特点，能zui大限度地减少操作误差和工作强度。
二、用途
定量检测动物组织 （肌肉、虾、鱼等）、血清和蜂蜜等样本中喹诺酮（QNS）的残留。
三、检测原理
本试剂盒采用竞争酶联免疫试验。检测的基础是抗原抗体反应，微孔板预包被羊抗鼠IgG捕获抗体，加入鼠抗喹诺酮抗体后，会与捕获抗体连接。经过孵育及洗板后，加入标准品、样品及喹诺酮酶标记物（QNS-HRP），游离的喹诺酮（QNS）与喹诺酮酶标记物（QNS -HRP）竞争喹诺酮抗体结合位点。经过孵育及洗板后，加入底物并孵育。结合的酶连接物将底物转化为蓝色的产物。加入反应终止液后使颜色由蓝转变为黄色。在450 nm 处测量，吸光度值与样品中的喹诺酮浓度成反比，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数即可得出样品中喹诺酮的含量。
四、检测限
检测限：0.1ng/ml（0.1ppb）
五、特异性
*………………………………………………*
*………………………………………………96.6%
*………………………………………………112.3%
达氟沙星………………………………………………98%
*……………………………………………… 134%
噁喹酸 ………………………………………………105.3%
氟甲喹 …………………………………………………96.1%
麻保沙星………………………………………………92.3%
氨氟沙星………………………………………………110%
*…………………………………………… 87.7%
培氟沙星……………………………………………129.6%
*……………………………………………100.7%
六、试剂盒组成
每一个盒中的试剂足够进行 96 个试验（包括标准测定），试剂盒中的组份如下：
1、96孔酶标板1块（12孔×8条）：预包被羊抗鼠IgG
2、标准液×6瓶（1ml/瓶）：
0ng/mL、0.1ng/mL、0.3ng/mL、0.9ng/mL、2.7ng/mL、8.1ng/mL
3、酶标记物（6mL）：辣根过氧化物酶标记的喹诺酮工作液
4、喹诺酮抗体（10mL）：鼠抗喹诺酮单克隆抗体工作液
5、底物液A（6mL）：过氧化脲
6、底物液B（6mL）：四甲基联苯胺（TMB）
7、终止液（6mL）：2N H2SO4
8、浓缩洗涤液（20×）（25mL）：含Tween-20的磷酸盐缓冲液（PBST）
9、其他：封板膜3张，自封袋1个，说明书1份
七、样本处理
1、溶液配制
配液1：8%甲醇-水溶液
量取8ml甲醇加入到92ml去离子水中混匀。
配液2：0.05M磷酸盐缓冲液（PH＝7.2）
称取12.9g十二水合*和2.18g二水合*，加去离离子水溶解定容至1L。
配液3：洗涤工作液
用去离子水将20×浓缩洗涤液按1：19体积比进行稀释（1份20×浓缩洗涤液+19份去离子水）用于酶标板的洗涤，洗涤工作液在4℃环境可保存一个月。
配液4：复溶工作液
用去离子水将2×浓缩复溶液按1：1体积比进行稀释（1份2×浓缩复溶液+1份去离子水）用于样本的复溶，复溶工作液在4℃环境可保存一个月。
2、样本处理前须知
处理任何样本时，都必须注意：
（a）实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。
（b）实验之前须检查各种实验器具是否干净，必须使用洁净实验器具，以避免污染干扰实验结果。
（c）未处理的样本冷冻保存。
3、蜂蜜前处理方法
方法一：
┅┅取1.0±0.05g 蜂蜜至50ml聚苯乙烯离心管中，加入5ml 8%甲醇-水溶液（见配液1），用涡旋仪涡动5min，使其充分溶解；
┅┅静止10min；
┅┅取100ml加入300ml复溶工作液， 用涡旋仪涡动混匀；
┅┅取50ml用于分析。
注：称取蜂蜜样本之前请于60℃水浴30-60min，振荡样本充分混匀后再取样。
方法二：
----取1.0±0.05g蜂蜜样本至50ml聚苯乙烯离心管中，加入2ml0.05M磷酸盐缓冲液（见配液2），用振荡器振荡至蜂蜜全部溶解；
----加入8ml二氯甲烷，用振荡器振荡5min,3000g以上离心5min；
----轻吸掉上层，取下层有机相4ml至10ml干净的玻璃试管中，于50～60℃氮气流下吹干；
----用1ml复溶工作液溶解干燥的残留物；
-----取50ml用于分析。
八、检测步骤
仔细的洗涤非常重要。避免在操作过程中微孔出现干燥。
1、将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温（20-25℃）平衡30min以上。
2、准备：取出需要数量的微孔板，将用剩的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。将微孔板条插入微孔架，标准品和样品做两个平行实验，记录下标准品和样品的位置。
3、加抗体：每孔加入100μL抗体溶液，37℃恒温箱孵育30分钟。
4、洗板：倒出孔中的液体，将微孔架倒置在干净吸水纸上拍打，以保证*除去孔中的液体。每孔加满稀释后的洗涤工作液，静置20秒钟，甩去液体，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次。
5、加标准品/样品：加入50μL标准品或处理好的样品到各自的微孔中，标准品和样品做两个平行实验，然后加入50μL酶标记物到微孔，小心地充分混合，37℃恒温箱孵育30分钟。
6、重复3的操作。
7、显色：每孔先加入底物液A 50μL，再加入底物液B 50μL，37℃避光孵育15min（如果显色过浅，可适当延长孵育时间，反之亦然）。
8、测定：每孔加入终止液50μL，设定酶标仪于450nm处，测定每孔OD值。
九、结果判定
（1）百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值（双孔）除以*个标准（0标准）的吸光度值，再乘以*，即
B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值
B0—0ppb标准溶液的平均吸光度值
（2）标准曲线的绘制与计算
以标准品百分吸光率为纵坐标，以喹诺酮标准品浓度（ppb）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中克仑特罗的实际浓度。
若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样本的准确、快速分析。（索取）
十、注意事项
1、严格按照说明书操作时间，每加一种试剂前需要将其摇匀，各操作步骤紧凑进行。
2、室温低于20℃或试剂及样本没有回到室温（20-25℃）会导致所有标准的OD值偏低。
3、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。
4、试剂变质的迹象
底物有任何颜色表明变质，应当弃之。0标准的吸光度（450/630nm）值小于0.5（A450nm<0.5 ）时，表示试剂可能变质。
5、不要使用过了有效日期的试剂盒；也不要使用过了有效期的试剂盒中的任何试剂，掺杂使用过了有效期的试剂盒会引起灵敏度的降低；不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。
6、在加入底物液A液和底物液B液后，一般显色15min即可。若颜色较浅，可延长反应时间到25min（或更长），但不得超过30min。反之，则减短反应时间。
7、反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。
十一、贮存条件及有效期
贮存条件：2-8℃、干燥避光防潮。
有效期：在正确贮存条件下，有效期为12个月。
