RNA制备中常见问题和解答

RNA制备中常见问题和解答

1、塑料制品、玻璃和金属物品的处理

(a)塑料制品：尽可能使用无菌,一次性塑料制品.已标明RNase-Free 的塑料制品,如没有开封使用过,通常没有必要再次处理.对于国产塑料制品,原则上都必须处理方可使用.处理方法如下：

(1)在玻璃烧杯中注入去离子水,加入DEPC使DEPC的终浓度为0.1%.注意：DEPC为剧毒物,活性很强,小心在通风柜中使用.

(2)将待处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中,注入DEPC水溶液,使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中.

(3)在通风柜中室温处理过夜.

(4)将DEPC水溶液小心倒到废液瓶中,用铝箔封住含已DEPC水处理过的塑料制品的烧杯,高温高压蒸气灭菌至少30分钟.

(5)烘箱用合适的温度烘拷至干燥.置于干净处备用.

(b)玻璃和金属物品

250°C烘烤3小时以上.

2、RNase 是RNA制备的杀手

答：RNase酶非常稳定,是导致RNA降解zui主要的物质.它在一些的条件可以暂时失活,但限制因素去除后有迅速复性.用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能是RNase*失活.它广泛存在于人的皮肤上,因此,在与RNA制备有关的分子生物学实验时,必须戴手套.RNase的又一污染源是取液器.根据取液器制造商的要求对取液器进行处理.一般情况下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部,基本达到要求.取 RNase-free的物品时必须戴手套.

3、采用什么方式纯化总RNA？

答：我们提供多种RNA纯化方式,根据您对RNA纯化技术的熟悉程度,选用不同的纯化手段.从产品使用效果看,基于TriBlue的一步法分离总RNA试剂盒（K311,K321系列）无论是新手还熟手都可以得到比较理想的结果.如果您对苯酚过敏,出于对环境的保护,您可以选用整个分离流程都不使用苯酚的试剂盒（K361系列）.从产品形式上,我们的总RNA分离分醇沉淀离心式和离心吸附柱方式两种.沉淀方式总的产量比较高,纯化规模机动,但是纯度不及吸附柱方式；吸附柱方式操作比较简单,纯度高,受吸附容量的影响,产量收到影响.

4、什么时候需要分离mRNA?

答：常规RT-PCR鉴定基因表达水平的,一般都可以采用总RNA作为RT-PCR 的模板,但是做cDNA文库,克隆丰度极低的基因,大多数DD-PCR, 削减杂交等需要纯化的mRNA.一般用oligo (dT)-cellulose或在磁珠上偶连oligo (dT),从组织或总RNA种直接分离mRNA.

5、如何判定分离的总RNA的纯度？

答：需要从两个方面着手,缺一不可,特别是新手（1）测定OD260/OD280的比值,测定时,RNA需要用10mM Tris-HCl,pH7.5稀释.理想的RNA, OD260/280在1.9-2.1之间.比值如果过低,可能有蛋白质污染,过高RNA可能已发生降解.（2）琼脂糖变性电泳观察rRNA的完整性和强度.变性电泳需要采用MOPS系统,不可以采用DNA 电泳用的TBE或TAE系统.如果OD260/OD280过低（<1.7）,通常可以通过减少组织和细胞的用量来实现.

6、什么时候需要加入RNA-Carrier?

答：样品很少或样品中RNA含量低,制备RNA时需要加入一定的 RNA载体,以提高RNA纯化的得率.常用的载体有PolyAcryl Carrier, Poly A, Poly C和Glycogen.一定浓度范围的 Carrier对一些RNA的下游应用没有影响,如RT-PCR, Northern Blot.

7、如何除去纯化的RNA中微量的基因组DNA?

答：无论用种方式制备的总RNA,要保证不含基因组DNA是不现实的.如果您希望得到DNA free 的RNA样品,需要用RNase free的DNase I处理.

8、纯化的RNA样品如何保存？

答：如果希望得到*的结果,纯化的RNA需要立即用于下游实验.RNA可以保存在-80C冰箱,长期保存可以置于液氮中.如果没有-80冰箱或液氮,RNA也可以保存在异丙醇或乙醇中,-20度保存.

9、组织和细胞样品如何收集,保存？

答：组织样品收集后,需要立即保存在液氮中,或在样品中加入一定量的保护剂,有一些商业化的产品可以选用.一般实验收集50-100mg组织就足够了.

10、如何估计RNA的产量？

答：能计算出RNA的产量,通常都是有比较多的起材料,但是很多情况下能够取得材料很少,所制备得到的RNA无法通过分光光度的方法测定含量和浓度.RNA的含量与组织和细胞的类型有比较大的关系, 同时与抽提的方式有关,例如用抽提小鼠组织100mg 肝可以得到500ug总RNA, 100mg肺 得到200ug总RNA, 1百万个细胞Hela细胞可以得到15ug左右的总RNA. mRNA的含量一般占总RNA含量的2-5%.根据这样一些经验值,估算出您可能得到的量.样品如果低于20mg或10000个细胞,在抽提时需要考虑加入合适的RNA沉淀载体.

11、RNA制备过程中那个环节要特别注意？

答：一般情况下,细胞和组织在RNA抽提液中都可以保存一段时间,因为几乎所有的RNA的抽提裂解液中都含有高浓度的异硫氰酸胍等强变性剂, RNase基本是不起作用的,操作即使是粗放一些,也没有多达关系.但是通常是离心后取上清,这时候RNA已没有保护,操作要特别小心.