本试剂盒采用双抗体夹心法，双抗体夹心原理，是基于要测试的抗原具有二价以上的特性，
能识别包被抗体，同时能识别检测抗体，具体过程如下：
（1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体，洗涤除去未结合的抗体及杂质，并用
无关蛋白封闭空余结合位点。
（2）加受检标本使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体
结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。
（3）加*标记抗体，使固相免疫复合物上的抗原与*标记抗体结合。*洗涤未
结合的*标记抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。
（4）加辣根过氧化物酶标记亲和素，使*标记抗体与辣根过氧化物酶标记的亲和素结
合。*洗涤未结合的酶标记物。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。
（5）加入底物显色，即可计算标本浓度。
（6）注：一个抗体分子上可以标记上若干个*分子，一个*分子可以结合一个辣
根过氧化物酶标记的亲和素，从而带来了大量的辣根过氧化物酶结合到抗体上，比传统的直
接辣根过氧化物酶标记抗体具有更高的敏感性和放大效应。
【鱼 GnRH 酶联免疫试剂盒检测原理】
本实验采用双抗体夹心 ELISA 法。所提供的 ELISA Kit 是典型的夹心法酶联免疫吸附测定
试剂盒（ELISA）。预先包被的抗体为抗鱼 GnRH 单克隆抗体。检测相抗体为多克隆抗体，
经*（biotin）标记。样品和*标记抗体先后加入酶标板孔反应后，PBS 或 TBS 洗
涤。随后加入过氧化物酶标记的亲和素反应；经过 PBS 或 TBS 的*洗涤后用底物 TMB
显色。TMB 在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色
的深浅和样品中的待测因子呈正相关。
【鱼 GnRH 酶联免疫试剂盒检测原理示意图】
*步
第二部
第三步
第四步
【试剂盒组成】
名称 96 Tests
48 Tests
保存条件
1．鱼 GnRH 抗体包被板条
8×12
8×6
4/-20℃
2．鱼 GnRH 标准品
2 支（冻干） 1 支（冻干）
4/-20℃
3．浓缩*化鱼 GnRH 抗体
1 支
1 支
4/-20℃
4．浓缩酶结合物(ABC)
1 支
1 支
4/-20℃
5. 酶结合物(ABC)稀释液 1 瓶 1 瓶 4/-20℃
6．抗体稀释液 1 瓶
1 瓶
4/-20℃
7．标准品稀释液 1 瓶
1 瓶
4/-20℃
8．样品稀释液 1 瓶
1 瓶
4/-20℃
9．浓缩洗涤液
1 瓶（25×）
1 瓶（25×）
4/-20℃
10．显色剂 A
1 瓶
1 瓶 (避光)
4/-20℃
11．显色剂 B
1 瓶 1 瓶
4/-20℃
12．终止液
1 瓶 1 瓶
4/-20℃
13．说明书
1 份 1 份
室温
【试验所需自备试验设备和器材】
1.
酶标仪(450nm 检测波长滤光片，570nm 或 630nm 校正波长滤光片) 。
2.
洗板机（可调注液量，保证每孔 350μl 洗液而不溢出）。
3.
超净工作台，生物安全柜，通风柜。
4.
高精度单道加液器（量程为 0.5-10μl, 2-20μl,20-200μl,200-1000μl).
5.
高精度多道加液器（8 道或 12 道，量程为 50-300μl).
6.
37℃恒温箱。
7.
低温离心机。
8.
电冰箱（4
,
℃ -20
,
℃ -86℃）.
9.
分析天平。
10. 剪刀，镊子，钳子等。
11. 漩涡混合仪，低频振荡器等。
【试验所需自备试验耗材及试剂】
1.
离心管（容量为 1.5ml，5ml 等）。
2.
一次性吸头（量程为 0.5-10μl, 2-20μl,20-200μl,200-1000μl）.
3.
纯净水或蒸馏水。
4.
坐标纸。
5.
吸水纸。
6.
EDTA，*，肝素
【标本收集注意事项】
1.
收集血液的试管应为一次性的无热原，无内毒素试管。
2.
血清和血浆避免使用溶血，高血脂标本。
3.
标本应清澈透明，悬浮物应离心去除。
4.
标本收集后若不及时检测，需按一次使用量分装，冻存于-20℃，-80℃电冰箱内，避免
反复冻融。
5.
可根据标本的实际情况，做适当倍数稀释(建议做预实验，以确定稀释倍数) 。
6.
收集标本，尽量做到双份的用量，避免一次实验失败，重复实验时标本缺失，从而耽误
实验进程。
7.
收集标本时，应该做好防护措施（比如戴手套，口罩，护目镜等），认为所有标本都具
有一定的潜在危险性。
8.
样本处理应该在生物安全柜里面，并且正确使用生物安全柜。
【标本处理办法】
1.
血清：将采集的全血静置冰箱 4℃过夜，然后 1000-3000rpm 离心 10 分钟，取上清立即
测试，暂时不测可以放入-20℃（1-3 个月）或-80℃（3-6 个月）保存。
2.
血浆：用 EDTA，*，肝素等作为抗凝剂，加入血液混匀后，1000-3000rpm 离
心 10 分钟，取上清立即测试，暂时不测可以放入-20℃（1-3 个月）或-80℃（3-6 个月）
保存。
3.
组织匀浆：切取组织块，0.01MPBS 中过洗一次；按照 1G 组织加入 5-10ml 组织蛋白萃
取试剂的比例，在冰水中匀浆。匀浆完成后，5000-10000rpm 离心 10 分钟，取上清立
即测试，暂时不测可以放入-20℃（1-3 个月）或-80℃（3-6 个月）保存。
4.
细胞培养上清：1000-3000rpm 离心 10 分钟，取上清立即测试，暂时不测可以放入-20℃
（1-3 个月）或-80℃（3-6 个月）保存。
5.
尿液，腹水，脑脊液等：1000-3000rpm 离心 10 分钟，取上清立即测试，暂时不测可以
放入-20℃（1-3 个月）或-80
3
℃ -6 个月）保存。
注：样品稀释的一般原则
用户须查阅相关文献了解标本内待测因子的含量，决定适当的稀释倍数，以使稀释后样
品中待测因子的浓度处于 ELISA 试剂盒的*检测范围。样品的稀释应有详细记录。
【注意事项】
1．试剂盒使用前请保存在 2-8℃。除复溶后的标准品，其他成分不可冻结。
2．浓缩*化鱼 GnRH 抗体，浓缩酶结合物体积小，运输中颠簸和可能的倒置，会
使液体沾到管壁或瓶盖。因此使用前请用手甩几下或 1000rpm 离心 1 分钟，以使附着管壁
或瓶盖的液体沉积到管底。
3．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，使结晶*溶解后再配
制洗涤液。
4．测试过程中，鱼 GnRH 冻干标准品为一次性使用，不得分装。因其浓度较低，溶解
两小时候后，会迅速失活。
5．操作严格按照说明书进行，本试剂不同批号组分不得混用。
6．配制试剂时，要用旋涡混合仪混匀。加入孔内的试剂，充分混匀对测试结果尤为重
要，使用微量振荡器(使用zui低频率)，如无微量振荡器，可在反应前手工轻轻晃动酶标
板 1 分钟，例如做圆周动作，使加入孔中的反应液混匀。
7．实验用酶标仪应严格按使用说明书规范操作，并在使用前充分预热。
8．酶免试验中鱼 GnRH 标准品和样本检测时建议作复孔。
9．将不用的微孔板放进原铝箔袋中，置 2-8℃保存。
10．显色液对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。
11．超过使用有效日期的试剂盒不能应用于实验中。
12．试验结果判定必须以酶标仪读数为准，使用双波长检测时，波长应该设置为 450nm
和 630nm.
13．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按生物废弃物处理。终止液为 2M 硫酸，使用
时必须注意安全。
14．各步骤加样均应使用加样器，并经常校准其准确性，以避免试验误差。一次加样时
间控制在 5 分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
15．每次试验测定的同时做标准曲线，做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本
OD 值大于标准品孔zui高浓度的 OD 值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n 倍）后再测定，
计算时请zui后乘以总稀释倍数（×n）。
16．不能检测含 NaN3 的样品，因 NaN3 抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
17．以洗板机洗板时,每孔注液量不应少于 350μl, 注意检查加样头是否堵塞。手工洗板
时, 用带纸屑的吸水材料应慎重, 防止外源性过氧化物酶类似物或氧化还原物与显色剂发生
反应。
18．用终止液终止反应后，请于 10 分钟内读取 OD 值。
19．进行复孔实验时，结果计算一定要求平均值。
20．标本溶血可能会有假阳性结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。
21．试验时，应该将加过样品的板条放于密闭盒内，并保持湿度约 60%左右。
22．为保证恒温箱内的温度为 37℃，恒温箱的温度要经常校准。以确保实验温度保持
恒定。
23．48T 的试剂盒，所有组分均为 96T 的 50%的量。
24．如与英文说明书有异，以英文说明书为准。
【检测前准备工作】
1. 请提前 20 分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温后方可进行试验。
2. 将浓缩洗涤液用双蒸水稀释(1:25)。未用完的放回 。
3. 鱼 GnRH 标准品: 加入标准品稀释液 1.0ml 至冻干鱼 GnRH 标准品中，静置 10 分钟，待
其充分溶解后，轻轻混匀(浓度为 1000 pg/ml)，之后在管身标注①，然后根据需要进行稀释。
(建议标准曲线使用以下浓度：1000、500、250、125、62.5、31.25、15.6 pg/ml)。 注意：务
必要保证冻干标准品*溶解和混匀。
4. 标准品稀释方法图例： 取 7 支洁净的试剂管，分别标注
,
,
,
,
,
,
.
② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ ⑧
每管加入
300μl 标准品稀释液。从第①管内取出 300μl 加入到第②管，混匀后，再从第②管取出 300μl
加入到第③管，以此类推至第⑦管。第⑧管为标准品稀释液，作为阴性对照使用。
注：复溶标准品原液（1000 pg/ml）请废弃，不可重复使用。
5.*化鱼 GnRH 抗体工作液：按当次试验所需用量，用抗体稀释液稀释浓缩*化抗
体(1:100)，配置成*化抗体工作液。使用前 30 分钟准备。仅供当日使用。
6.酶结合物工作液：按当次试验所需要用量，用酶结合物稀释液稀释浓缩酶结合物(1:100)，
配置成酶结合物工作液。使用前 30 分钟准备。仅供当日使用。
7.TMB 显色工作液：在使用之前 30 分钟，按 TMB 显色液 A 9 份加 TMB 显色液 B 1 份（9：
1）的比例配制 TMB 显色工作液。
【洗涤方法】
1．自动洗板机：要求注入的洗涤液为 350μl，注入与吸出间隔 20－30 秒。确保机器运用熟
练后，再投入实验中使用。
2．手工洗板：每孔加洗涤液 350μl，静置 30 秒后甩尽孔内液体，在吸水纸上拍干。手工洗
板时，注意加入洗液的过程中，不要造成孔间污染，从而出现跳孔的现象。
【操作步骤】
1.
从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条，未用的板条和干燥剂请放回铝箔袋内封
存于 2-8℃。
2.
预留空白孔（若使用双波长读板，空白孔可以不设）。
3.
分别将标本或不同浓度鱼 GnRH 标准品（0pg/ml 孔加标准品稀释液）加入相应孔中
(100μl/孔)，用封板胶纸封住反应孔，37℃孵箱孵育 90 分钟。
4.
提前 30 分钟制备*化鱼 GnRH 抗体工作液。
5.
洗板 3 次。
6.
加入*化鱼 GnRH 抗体工作液(100μl/孔)。用封板胶纸封住反应孔，37℃孵箱孵育
60 分钟。
7.
提前 30 分钟制备酶结合物工作液。室温避光放置。
8.
洗板 3 次。
9.
除空白孔外，加入酶结合物工作液(100μl/孔)。用封板胶纸封住反应孔，37℃孵箱，避
光孵育 30 分钟。
10. 洗板 5 次。
11. 加入 TMB 显色工作液（包括空白孔）100μl/孔，37℃孵箱，避光孵育，当标准曲线高
浓度的颜色较深，有明显的颜色梯度的时候，即可终止。试验显色反应请勿超过 30 分
钟。
12. 加入终止液（包括空白孔）100μl/孔，混匀后即刻测量 OD（450nm）值(10 分钟内)。
【结果判断】
1．每个标准品和标本的 OD 值应减去零孔的 OD 值。（若不减零孔值，标准曲线的零孔应相
交于 Y 轴）
2．手工绘制标准曲线。以标准品浓度作横坐标，OD 值作纵坐标，以平滑线连接各标准品
的坐标点。通过标本的 OD 值可在标准曲线上查出其浓度。推荐使用专业制作曲线软件进行
分析，如 curve expert 1.3 进行结果计算。
3．若标本 OD 值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。
【参考曲线】
注意：本图仅供参考，应以同次试验标准品所绘标准曲线来计算标本含量。
【操作程序总结】
准备试剂，样品和标准品
加入准备好的样品和标准品，37℃反应 90 分钟
洗板 2 次，加入*化抗体工作液，37℃反应 60 分钟
洗板 3 次，加入 ABC 工作液，37℃反应 30 分钟
洗板 5 次，加入 TMB 显色液，37℃反应
加入 TMB 终止液
10 分钟之内酶标仪测 OD 值
计算标本待测因子含量
试剂盒参数
【检测范围】1000pg/ml-15.6pg/ml
【灵敏度】zui小可测鱼 GnRH 达 5pg/ml.
【特异性】系统和其它因子无交叉反应。
【批间差】≤12%.
【批内差】≤8%.
【回收率】70-110%.
【保存】-20
[
℃ 短期内（如两周）可 4
]
℃
【用途】用于体外定量分析液体标本（通用型）。
【规格】96T.
【生产日期】见酶标板铝箔袋封口钢印。
【有效期】12 个月（-20℃）.