凝集反应（直接凝集反应和间接凝集抑制试验）

齐一生物科技（上海）有限公司技术部整理分享：

【原理及意义】
颗粒性抗原（如细菌、细胞）与相应抗体特异性结合，在适当的电解质环境中形成肉眼可见的凝集块的现象，称为凝集反应。包括直接凝集反应（细菌或细胞等颗粒性抗原与相应抗体直接反应出现的凝集现象）和间接凝集反应（将可溶性抗原包被在红细胞或乳胶颗粒表面，再与相应抗体发生反应出现的凝集现象）。凝集反应广泛地应用于疾病的诊断和各种抗原性质的分析。
（一）直接凝集反应
（1）玻片凝集反应鉴定细菌
【材料】
１试剂：1∶10稀释的伤寒杆菌诊断血清，伤寒杆菌、痢疾杆菌24小时琼脂斜面培养物，生理盐水。
２器材：玻璃蜡笔，载玻片，毛细吸管。
【方法】
１取清洁玻片一张，用蜡笔划为三格，并注明号码。无菌操作下，用接种环于1、2格内加1∶10稀释伤寒杆菌诊断血清1～2滴，第三格加1～2滴生理盐水。
２无菌操作下，用接种环取伤寒杆菌培养物少许，混于第三格中，再混于*格中（不能先混于*格再混于第三格，因为这样将使诊断血清混入盐水而影响对照结果），将细菌与盐水或血清混合均匀使呈乳状液。此时取菌量不可过多，使悬液呈轻度乳浊即可。
３同法取痢疾杆菌培养物少许，于第二格内混匀。
４轻轻摇动玻片，经1～2分钟后肉眼观察，出现乳白色凝集块者，即为阳性反应；仍为乳浊液者，即为阴性反应。
（2）玻片凝集反应鉴定ＡＢＯ血型
ＡＢＯ血型系统可分为四种血型：Ａ型、Ｂ型、ＡＢ型和Ｏ型。ＡＢＯ血型系统中有Ａ、Ｂ两种凝集原，红细胞膜上含Ａ凝集原者称为Ａ型血，含Ｂ凝集原者称为Ｂ型血，同时含Ａ、Ｂ两种凝集原者称为ＡＢ型血，无Ａ、Ｂ凝集原者称为Ｏ型血。同时，在人类血清中含有与上述凝集原相对应的天然凝集素，即抗体。ＡＢＯ血型鉴定是用已知的标准Ａ型血清（含Ｂ凝集素）和Ｂ型血清（含Ａ凝集素），分别与被鉴定人的红细胞相混合，依其发生凝集反应的结果判定被鉴定人红细胞表面所含的凝集原而确定的。在正常情况下，ＡＢＯ血型系统中只有相同血型的人才能进行输血，仅在无法得到同型血液的特殊情况下，才可考虑将Ｏ型血输给其他血型的人，而且限定在300mL以内，并且应缓慢输入。
【材料】
１试剂：标准Ａ血清，标准Ｂ血清，酒精棉球，无菌干棉球。
２器材：玻璃蜡笔，载玻片，采血针，毛细吸管。
【方法】
１取清洁玻片一张，用蜡笔划为二格，注明号码，并分别滴加标准Ａ血清和标准Ｂ血清各一滴。
２无菌操作下，用采血针收集受试者耳垂或指端外周血0.5～1mL。
３分别滴加受试者外周血一滴。
４轻轻摇动玻片，经1～2分钟后肉眼观察。如两者均凝集则为ＡＢ型血，均不凝集则为Ｏ型血，Ａ标准血清凝集而Ｂ标准血清不凝集则为Ａ型血，Ａ标准血清不凝集而Ｂ标准血清凝集则为Ｂ型血。
（3）试管凝集反应
【材料】
１试剂：1∶10稀释的伤寒诊断血清，菌液（伤寒杆菌“Ｈ"菌液，伤寒杆菌“Ｏ"菌液），生理盐水。
２器材：试管架，小试管，吸管，玻璃蜡笔。
【方法】
１取洁净小试管14只分两排排列于试管架上，每排7只依次用蜡笔注明号码，于每
管中分别加入0.5mL生理盐水。

２在第1排第1管中加入1∶10稀释伤寒杆菌“Ｈ"血清0.5mL，再加入生理盐水0.5mL于管内,连续吹吸3次，使血清与盐水充分混合，而后吸出0.5mL注入第2管，同样再加入生理盐水0.5mL于管内予以混匀后吸出0.5mL注入第3管。依次类推，稀释到第6管，自第6管吸出0.5mL弃去。此时，自第1管至第6管的血清稀释倍数依次为1∶20，1∶40，1∶80，1∶160，1∶320，1∶640。第7管不加血清作为对照。
３同法用吸管吸取1∶10稀释伤寒杆菌“Ｏ"血清加入第2排第1管，并依次如上法予以稀释。
４用移液管吸取伤寒杆菌“Ｈ"菌液0.5mL分别加入第1排各管中，此时血清稀释倍数又增加了一倍。
５同法于第2排各管中分别加入伤寒杆菌“Ｏ"菌液0.5mL。
６将各管振荡混匀，放37℃水浴箱中2～4小时或37℃孵育箱中过夜次日取出观察
结果。
【观察结果】
１观察之前切勿摇动试管，以免凝集块分散。
２先观察对照管，此管应无凝集现象，管内液体仍成混浊状态。但如放置时间较长，细菌堆于管底成小圆点状，为阴性反应。
３试验管应自第１管观察起，如有凝集时则于管底有不同大小的圆片状边缘不整齐的凝集物，上液则澄清透明或不同程度混浊。凝集的强弱可用“＋"号表示如下：
“＋＋＋＋"凝集很强，管内液体*澄清，凝集块*沉于管底；
“＋＋＋"凝集强，管内液体不*澄清，稍有轻度混浊，凝集块沉于管底；
“＋＋"凝集中等强度，液体半澄清，凝集块沉于管底；
“＋"凝集弱，管内液体混浊，少量凝集块沉于管底；
“－"不凝集，管内液体和对照管同样混浊，无凝集块。
４zui后轻轻振荡各管，观察凝集块的状态，对照管的细菌在振荡时呈烟雾状上升，随即消散，细菌分散仍呈混浊状态。“Ｈ"菌液的凝集块疏松呈棉状，大片沉于管底，轻摇即升起，并极易破碎。“Ｏ"菌液凝集呈紧密颗粒状，沉于管底坚实致密，轻轻振摇不易升起，凝集颗粒较小不易摇碎。
５记录观察的结果并判定凝集效价，通常以能产生明显凝集（＋＋）的血清zui大稀释倍数作为该血清的凝集效价。如血清的zui低稀释度（即第1管1∶40）仍无凝集，应报该血清效价低于1∶40。如血清的zui高稀释度（即第6管1∶1280）仍显*凝集现象，应报该血清效价高于1∶1280。
（二）间接凝集抑制试验
【原理及意义】
若使可溶性抗原与相应抗体先充分反应再加入有关的免疫微球，因抗体已被可溶性抗原结合，不再出现免疫微球的被动凝集现象，叫间接凝集抑制试验，临床化验检查中常用的免疫妊娠试验就是一种间接凝集抑制试验。
妊娠试验：孕妇尿中绒毛膜促性腺激素（HCG）的含量比正常尿中的高。妊娠尿中加入抗绒毛膜促性腺激素抗体时，由于发生抗原抗体反应的结果，抗体被消耗，此时再往尿中加入乳胶抗原（吸附有人类绒毛膜促性腺激素的乳胶颗粒），不再发生反应，抗原仍呈乳状液体，即为妊娠试验阳性。反之，被检尿中绒毛膜促性腺激素含量甚少（非妊娠尿）不足以把加入的抗体消耗，当乳胶抗原加入后，抗体便与抗原结合发生反应，出现均匀细小颗粒，妊娠试验为阴性。
【材料】
１试剂：吸附有人类绒毛膜促性腺激素的乳胶抗原，抗人类绒毛膜促性腺激素抗体血清，孕妇尿，正常尿。
２器材：黑反应板，玻璃蜡笔，滴管。
【方法】
１取清洁玻片一张，用蜡笔划为二格，注明号码，并分别滴加妊娠尿和正常尿各一滴。
２分别滴加含抗人类绒毛膜促性腺激素抗体血清各一滴，轻轻摇动，充分混匀。
３分别滴加一滴乳胶抗原，缓慢摇动3～5分钟，观察结果：不出现凝集者为阳性，其尿中含有HCG，表示妊娠；出现凝集者为阴性，其尿中不含有HCG，表示未妊娠。
【注意事项】
１试验材料、用具使用前使其温度接近室温（20℃左右）。
２被检尿太混浊，需要过滤。
３尿中有蛋白及血液时，不宜进行此试验。