蛋白纯化的三种新工具-齐一生物编

蛋白纯化的三种新工具-齐一生物编

蛋白亲和标签是蛋白质组研究中的一个关键性工具，迄今为止人们已经开发出了许多久经考验的蛋白标签系统，例如六聚组氨酸、HA、Myc和FLAG等等。尽管这些标签系统各具特色，但它们也分别存在着一些缺陷，还不能*研究者们的需要。

为此，Biotechniques杂志盘点了近期出现的三种新蛋白标签系统，以便为研究者们提供更大的选择空间。这三种蛋白标签系统分别利用了高亲和力单抗、无机矿物基质、以及能够剪切标签的金属离子。（阅读：2013年蛋白质分析文章精选）

单克隆抗体标签!--?xml:namespace prefix = o ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:office" /--

日本研究者Yukinari Kato在开发胶质母细胞瘤的治疗性抗体时，无意中发现了一个可用作亲和标签的肽段。Podoplanin蛋白是一个在恶性癌细胞中高度表达的跨膜蛋白，Kato生成的大鼠单克隆抗体NZ-1可以靶向该蛋白中一个14个残基的肽段。Kato在ELISA实验中注意到，NZ-1与podoplanin蛋白的亲和力特别高，于是他与大阪大学的Junichi Takagi合作，希望将其开发成为一个蛋白标签系统。

研究人员将与NZ-1结合的podoplanin肽段称为PA标签，并将其与现有的其他标签系统进行比较（FLAG、HA和Myc）。他们发现，NZ-1和PA标签之间的亲和力更高，解离更慢。Takagi尝试用这一系统来分离，哺乳动物细胞分泌到培养基中的重组蛋白。这些重组蛋白的初始浓度较低，比较难于分离和纯化。

研究人员发现，细胞培养液上清中的PA标记蛋白，能够有效结合NZ-1-琼脂糖。此外，0.1 mg/ml的PA标签溶液可以将融合蛋白竞争性的洗脱下来。随后，Takagi又通过NZ-1-琼脂糖层析纯化了15种不同分子量的分泌蛋白，这些蛋白的纯度都超过了95%。

据介绍，这一系统的关键优势在于，可以在无损抗体柱的情况下很方便的进行再生。研究显示，高盐缓冲液可以*去除结合在抗体上的PA标签，进行60次结合-洗脱-再生的循环，也不会对柱子的结合能力产生任何影响。

目前，上述系统还不能兼容人类细胞。“我们正在晶体结构的引导下，设计不识别人类podoplanin的改进版NZ-1，只保留它与标签肽段的高亲和力，”Takagi说。他现在正努力将这一标签系统应用到蛋白质组分析中去，希望能够用其替代FLAG标签。

磷灰石基质

人们常常用固化的抗体和金属离子来纯化重组蛋白，不过这些方案并不，存在着金属离子析出、稳定性低、和成本高等问题。为此。Jacobs大学的Marcelo Fernandez-Lahore用无机矿物氟磷灰石，开发了一个新的亲和标签纯化系统。

以磷酸钙为基础的磷灰石（例如羟磷灰石和氟磷灰石），几十年来一直被用作生物分子的吸附剂，其优势在于这种物质既没有抗原性也没有细胞毒性。然而，人们一直未能将它们用于层析法蛋白纯化。这是因为此前的磷灰石基质“颗粒形状不规则，而且在某些条件下很容易溶解，”Fernandez-Lahore说。而近期商业化的CFT珠（macroporous ceramic fluorapatite）解决了上述问题。

Fernandez-Lahore实验室在这种材料的基础上，开始寻找与氟磷灰石高度亲和的标签肽段。研究人员通过噬菌体展示筛选，发现肽段KPRSVSG与CFT的结合能力很强，于是他们决定将这个CFT结合肽段（CBP）开发成为蛋白纯化的亲和标签。

研究团队在CFT柱层析实验中发现，由赖氨酸组成的肽段滞留时间更长。于是他们又添加了六个赖氨酸，对原本的CBP进行优化。研究显示，用这种标签纯化融合蛋白，纯度超过了90%。

研究人员指出，与使用固化抗体或金属离子的传统系统相比，CBP/CFT珠组成的系统可以弥补一些缺陷，是蛋白亲和纯化的另一条宝贵途径。未来，研究人员将会用这一系统，对不同大小、不同特性、不同表达系统（例如哺乳动物或酵母表达系统）的蛋白进行测试。Fernandez-Lahore还指出，这一标签可以“实现可逆的固化，有望应用于医学诊断或细胞分析。”

二合一系统？

尽管许多蛋白与亲和标签融合后也能够正常工作，但不少实验还是要求去除这些标签。人们往往将剪切位点设计在蛋白标签旁边，以便用蛋白酶消化时能够将其切下来。

为了进一步简化这一过程，哥本哈根大学的Niels Erik Møllegaard提出了一个有趣的新标签系统。在该系统中，一个分子可以同时实现亲和结合和蛋白标签的剪切，这个分子就是二价铀酰离子（UO22+）。

Møllegaard及其团队研究DNA和RNA的铀酰（uranyl）剪切已经几十年了。“这种物质的剪切能力在于它能与磷酸基团高度亲和，” Mollegaard说。“我们尝试用它进行蛋白剪切也有好几年了。”

四年前研究团队发现，铀酰可以在蛋白中对磷酸化的进行光切割。研究人员随即想到，可以合成一个包含特异性磷酸化位点的标签，使其与固化的铀酰离子结合，该系统可以在光切割后释放出纯化的无标签重组蛋白。

Møllegaard决定先将这一系统开发成为C端标签，因为此前的工作显示铀酰切割发生在磷酸化的N端，这样就可以实现C端标签的*切除。蛋白酶剪切无法*去除这样的标签，因为它的剪切发生在识别位点的C端。

研究人员选择酪蛋白激酶CKII作为磷酸化标签肽段的激酶，因为这种酶的磷酸化发生在识别序列N端的上。他们设计的标签序列是SSDDD，其中三个天冬氨酸负责与铀酰结合，两个作为磷酸化位点。

研究人员将该标签的 C端与GFP融合，并在细菌中进行表达，随后他们用CKII处理细菌的裂解物。研究显示，磷酸化只发生在标签中的位点上。在与铀酰- NTA-琼脂糖珠混合时，磷酸化的GFP-tag与琼脂糖珠发生了有效的特异性结合，而这样的结合可以被磷酸钠缓冲液洗脱。

为了研究铀酰切割的具体情况，研究人员在细胞裂解物中对GFP-tag进行了CKII处理，然后在溶液中加入铀酰，并进行了UV照射。他们观察到，蛋白标签出现了光依赖性的切除。不过ESI-MS显示，GFP的zui后一个赖氨酸也被切掉了，说明该系统还需要进一步优化，让剪切位点更为。

现在，Møllegaard正在尝试对结合在铀酰- NTA-琼脂糖珠上的融合蛋白进行光切割，以便将其发展成为蛋白分离和标签切除的一步法系统。“还有许多步骤有待优化，举例来说，我们需要优化紫外线照射，以便在纯化柱上进行更有效的光切割，”Møllegaard指出。

参考文献：

1. Fujii Y., M. Kaneko, M. Neyazaki, T. Nogi, Y. Kato, and J. Takagi. 2014. PA tag: A versatile protein tagging system using a super high affinity antibody against a dodecapeptide derived from human podoplanin. Protein Expr Purif. 95:240-7. doi: 10.1016/j.pep.2014.01.009. Epub 2014 Jan 28. 

2. Islam, T., J. M/ Aguilar-Yañez, J. Simental-Martínez, C. I. Ortiz-Alcaraz, M. Rito-Palomares, and M. Fernandez-Lahore. 2014. A novel strategy for the purification of a recombinant protein using ceramic fluorapatite-binding peptides as affinity tags. J Chromatogr A. http://dx.doi.org/10.1016/j.chroma.2014.02.079. Available online 5 March 2014 

3. Zhang, Q., T.J. Jørgensen, P.E. Nielsen, and N.E. Møllegaard. 2014. A phosphorylation tag for uranyl mediated protein purification and photo assisted tag removal. PLoS One. 2014 Mar 5;9(3):e91138. doi: 10.1371/journal.pone.0091138. eCollection 2014.