可溶性淀粉合成酶试剂盒说明书齐一生物

可溶性淀粉合成酶（Soluble starch synthase，SSS）试剂盒说明书

分光光度法 25 管/24 样

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义

SSS（EC 2.4.1.21）通常以游离态存在于质体基质中，催化淀粉链延长，主要负责支链淀粉的合成。
可溶性淀粉合成酶（Soluble starch synthase，SSS）试剂盒说明书测定原理

SSS 催化 ADPG 与淀粉引物(葡聚糖)反应，将葡萄糖分子转移到淀粉引物上，同时生成 ADP，在反应体系中添加的丙酮酸激酶、己糖激酶和 6-磷酸葡萄糖脱氢酶依次催化 NADP+还原为NADPH，NADPH 生成量与前一步反应中 ADP 生成量呈正比，340nm 下测定 NADPH 增加量即可计算 SSS 活性。

需自备的的仪器和用品

紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、移液器、1 mL 石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制

可溶性淀粉合成酶（Soluble starch synthase，SSS）试剂盒说明书提取液：液体 30mL×1 瓶，4℃保存；
液体一：7mL×1瓶，4℃保存；
液体二：4mL×1 瓶，4℃保存；
液体三：8mL×1 瓶，4℃保存；
粉剂一：1 支，4℃保存；
粉剂二：1支，4℃保存；
粉剂三：1 支，-20℃保存；
粉剂四：1 支，4℃保存；
粉剂五：1 支，4℃保存；
粉剂六：1 支，-20℃保存；
粉剂七：1 支，-20℃保存；
粉剂八：1 支，4℃保存；
粉剂九：1 支，4℃保存；
粉剂十：1 支，-20℃保存；
试剂一：液体×1 支，-20℃保存；临用前加入 250μL 蒸馏水，充分溶解备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

试剂二：粉剂×1 支，-20℃保存；临用前加入 250μL 蒸馏水，充分溶解备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

反应液Ⅰ的配制：临用前取液体一、粉剂一、粉剂二和粉剂三各一支，依次把粉剂一、粉剂二和粉剂三转移到液体一中混合溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。反应液Ⅱ的配制：临用前取液体二、粉剂四、粉剂五、粉剂六和粉剂七各一支，依次把粉剂四、粉剂五、粉剂六和粉剂七转移到液体二中混合溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

反应液Ⅲ的配制：临用前取液体三、粉剂八、粉剂九和粉剂十各一支，依次把粉剂八、粉剂九和粉剂十转移到液体三中混合溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
粗酶液制备

按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
测定步骤

1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、在 EP 管中按顺序加入下列试剂

试剂名称（μL）    测定管
    
样本    150
    
反应液Ⅰ    270

混匀，30℃保温 20 min，置沸水浴中 1 min（盖紧，防止水分散失），冰浴冷却

反应液Ⅱ    150

混匀，30℃保温 30 min，置沸水浴中 1 min（盖紧，防止水分散失），
    冰浴冷却，10000g 25℃离心 10min，取上清液
上清液        450
反应液Ⅲ        300
试剂一        10
试剂二        10

混匀后立即在 340 nm 波长下记录初始吸光度 A1 和 2min 后的吸光度 A2，计算 ΔA=A2-A1。注意：反应液Ⅰ如有沉淀，加入之前要使之充分溶解混匀。

可溶性淀粉合成酶（Soluble starch synthase，SSS）试剂盒说明书SSS 活性计算

1、按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

SSS（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(Cpr×V 样) ÷T×稀释倍数

=522×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。2、按照样本鲜重计算

单位的定义：每 g 组织每分钟催化产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

SSS 活性（nmol/min/g 鲜重）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷（V 样÷V 样总×W）÷T×稀释倍数=522×ΔA÷W 
V 反总：反应体系总体积，5.7×10-4 L；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.15 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，2 min；稀释倍数：1.71；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量。