总抗氧化能力检测试剂盒（ABTS法）

使用说明：

1. ABTS工作液的配制：

   (1) 参考下表，根据待测定样品的数量(含标准曲线)配制适量的ABTS工作液：

      ABTS工作母液配制后，室温避光存放12-16小时后方可使用。配制好的ABTS工作母液室温避光存

      放，在2-3天内稳定。

      在使用前，把ABTS工作母液用PBS或80%乙醇稀释成ABTS工作液，要求ABTS工作液的吸光度减去相

      应的PBS或80%乙醇空白对照后，A734为0.7±0.05。当待检测样品为水溶性样品时，用PBS稀释，

      此时ABTS工作母液的稀释倍数约为90-100倍；当待检测样品为非水溶性样品时，用80%乙醇稀释，

      此时ABTS工作母液的稀释倍数约为100-110倍。

2. 待测样品的准备：

   (1) 血清、血浆、唾液或尿液样品的准备：

       血清、血浆、唾液或尿液样品每个样品需要10微升，都可以直接用于测定。血清、血浆、唾液或

       尿液样品都可以使用新鲜样品进行测定，也可以-80℃冻存后再进行测定。-80℃冻存的样品至少

       在一个月内所测定获得的数据没有显著变化。注意：血浆制备时可以使用肝素或柠檬酸钠抗

       凝，不宜使用EDTA抗凝。根据文献报道，人血清或血浆中的总抗氧化能力为0.5-2mM，人唾液中

       的总抗氧化能力为0.3-1mM，人尿液中的总抗氧化能力为0.2-3mM。

   (2) 细胞或组织样品的准备：

       对于细胞样品，收集约100万个细胞(不必计数，直接刮下，不宜使用胰酶和EDTA消化)，放

       置在200微升冰冷的PBS或HBSS溶液中，匀浆或超声以充分破碎细胞并释放其中的抗氧化物，4℃ 

       约12000g离心5分钟，取上清用于后续测定。对于组织样品，每20mg组织加入100微升冰冷的PBS

       或HBSS溶液，匀浆或超声以充分破碎组织并释放其中的抗氧化物，4℃ 约12000g离心5分钟，取

       上清用于后续测定。以上所有操作均需在4℃或冰上操作。制备好的细胞或组织样品的上清如果

       不立即用于测定，可以在-80℃冻存。-80℃冻存的样品至少在一个月内所测定获得的数据没有显

       著变化。细胞或组织样品在测定总抗氧化能力时需同时测定蛋白浓度，zui后测定获得的总抗氧化

       能力通常表示为每毫克或每克蛋白重量中的总抗氧化能力，表示单位为mmol/mg或mmol/g。

   (3) 其它样品的准备：

       植物或中草药抽提液都可以直接用于检测。需注意样品本身的颜色不会干扰检测。植物或中草药

       抽提液的抗氧化能力可以表示为每毫克或每克抽提物干重中的总抗氧化能力，表示单位为

       mmol/mg或mmol/g。各种抗氧化物测定其抗氧化能力时，通常配制成0.15-1.5mM，然后进行测

       定。抗氧化物的浓度可以以摩尔浓度表示时，测定获得的总抗氧化能力可以用相对总抗氧化能力

       进行表示，例如0.5mM的某抗氧化物其测定获得的OD值和1mM的Trolox测定获得的OD值相同，则其

       相对总抗氧化能力为2，再如0.2mM的某抗氧化物其测定获得的OD值和1mM的Trolox测定获得的OD

       值相同，则其相对总抗氧化能力为5。根据文献报道和实际测定结果，维生素C的抗氧化能力为

       1.0，维生素E的抗氧化能力为1.0，GSH的抗氧化能力为1.3，Uric acid的抗氧化能力为1.0，

       β-Carotene的抗氧化能力为2.6，Lycopene的抗氧化能力为3.1，Quercetin的抗氧化能力为

       3.0，鲜橙汁的总抗氧化能力为2.2。

3. 标准曲线测定的准备：

        用蒸馏水或样品配制溶液稀释标准品。对于血清、血浆、唾液或尿液样品直接用蒸馏水或

        PBS稀释标准品，对于细胞或组织样品，用用于细胞或组织匀浆的溶液稀释标准品，其它样

       品则用样品配制溶液对标准品进行稀释，或选择PBS或80%乙醇来稀释标准品。把10mM Trolox

        标准溶液稀释成0.15、0.3、0.6、0.9、1.2和1.5mM。

4. 总抗氧化能力的测定：

   (1) 96孔板的每个检测孔中加入200微升ABTS工作液。

   (2) 空白对照孔中加入10微升蒸馏水或PBS等适当溶液；标准曲线检测孔内加入10微升各种浓度的

       Trolox标准溶液；样品检测孔内加入10微升各种样品。轻轻混匀。

   (3) 室温孵育2-6分钟后测定A734。如果测定A734有困难，也可以在725-745nm范围内进行测定。

   (4) 根据标准曲线计算出样品的总抗氧化能力。如果样品测定出来的吸光度在标准曲线范围以外，

       需把样品适当稀释或浓缩后再进行测定。

   (5) 总抗氧化能力的表示方式：

       在采用Trolox作为标准品进行总抗氧化能力检测时，样品的抗氧化能力可以用Trolox-

       Equivalent Antioxidant Capacity (TEAC)来表示。对于混合物例如血浆、血清、唾液或尿

       液等的抗氧化能力，可以直接用Trolox的摩尔浓度来表示，例如某样品测定获得的抑制率和

       0.6mM的Trolox相同，则该样品的总抗氧化能力为0.6mM；再如某样品稀释5倍后测定获得的抑

       制率和0.5mM的Trolox相同，则该样品的总抗氧化能力为2.5mM。对于细胞或组织裂解液等，例

       如某裂解液样品的蛋白浓度为0.15mg/ml，测定获得的抑制率和0.3mM Trolox相同，则该裂解液

       样品的总抗氧化能力为0.3mM/0.15mg/ml，即为2mmol/g。对于植物或中草药抽提物，例如某样

       品的浓度为0.1mg/ml，测定获得的抑制率和0.5mM Trolox相同，则该样品的总抗氧化能力为

       0.5mM/0.1mg/ml，即为5mmol/g。对于纯的化合物例如维生素C、GSH等，例如使用1mM某样品检

       测时的抑制率相当于1.5mM Trolox时，该样品的抗氧化能力为1.5mM，再如使用0.5mM某样品检

       测的抑制率相当于0.8mM Trolox时，该样品的抗氧化能力为1.6mM。