Interleukin 6（IL-6）mRNA原位杂交试剂盒

1
                  Interleukin 6（IL-6）
       Interleukin 6（IL-6） mRNA原位杂交试剂盒
 
产品编号：QY-10045
保存：置４℃。
工作量：100张切片。
有效期：一年。
适用种属：人、大鼠 。
试剂盒中内容
    1.Interleukin 6（IL-6）   寡核苷酸探针杂交液       2ml；
  2.预杂交液                     2ml；
  3.胃蛋白酶（×10;Pepsin）      2ml；
  4.封闭液                       5ml；
  5.化鼠抗地高xin          5ml；
  6.SABC-POD                     5ml；
  7.化过氧化物酶           5ml。
用户自备试剂：原位杂交盖玻片；POLY-L-LYSINE；DEPC；20%甘油
缓冲液（3%柠檬酸,2×SSC，0.5×SSC，0.2×SSC， 原位杂交用PBS ）
一．培养细胞和冰冻切片
准备工作：
固定液： 4% 多聚甲醛 /0.1 M PBS （PH7.2-7.6 ）； 1% 多聚甲醛 /0.1 M
PBS （ PH7.2-7.6 ） 3% 柠 檬 酸 — — 100ml 蒸 馏 水 中 加 柠 檬 酸
（C6H8O7·H2O）3g,PH2.0左右。2×SSC——1000ml 蒸馏水中加氯化钠17.6g，
柠檬酸三钠（C6H5O7Na3·2H2O，分子量294）8.8g。 0.5×SSC——300ml 蒸馏水
加100ml 2×SSC 即可。0.2×SSC——270ml 蒸馏水加30ml 2×SSC 即可。20%甘油
——20ml 甘油加 80ml 蒸馏水即可。原位杂交用 PBS——0.02M phosphate ；
0.5M NaCl(1000ml  蒸馏水加氯化钠 30g,Na2HPO4·12H2O6g,  NaH2PO4·2H2O
0.4g),PH7.2-7.6。
操作程序： 注意：zui重要的是及时固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC 处理，
以抑制RNA 酶对mRNA 的分解作用。此外，过度固定对原位杂交有明显的不利
影响。
1．玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或APES。切片厚度10-20μm。
2．细胞在多聚赖氨酸处理的盖玻片上进行培养，条件为37℃和5%的CO2，所
用培养基为
Dulbecco 基础培养基。细胞长好后0.1M PBS(PH7.4)洗2 分钟×3 次。
3．培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定：固定液为 4%多聚甲醛/0.1 M
PBS（PH7.2-7.6），含有1/1000 DEPC。室温固定20--30 分钟。蒸馏水充分洗涤
干燥后-20℃冰冻可保存2 周以2
上。
4．30%H2O2 1 份+纯甲醇50 份混合，室温处理30 分钟。蒸馏水洗涤3 次。
5．暴露mRNA 核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶（1ml 3%
柠檬酸加2 滴浓缩型胃蛋白酶，混匀），37℃或室温消化5—120 秒钟。有时也
可以不消化。原位杂交用PBS 洗3 次×5 分钟。蒸馏水洗1 次。
6.后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液为 1%多聚甲醛/0.1 M PBS（PH7.2-
7.6），含有1/1000DEPC。室温固定10 分钟。蒸馏水洗涤3 次。
7. 预杂交：湿盒的准备——干的杂交盒底部加20%甘油20ml 以保持湿度。按每
张切片20μι
加预杂交液。恒温箱38-42 2—4  ℃ 小时。吸取多余液体，不洗。
8. 杂交——按每张切片20μι杂交液，加在切片上。将原位杂交盖玻片的保
护膜揭开后，
盖在切片上。恒温箱38-42℃杂交过夜(根据杂交情况可以调节)。
9.  杂交后洗涤：揭掉盖玻片，37℃左右水温的 2×SSC 洗涤 5 分钟×2 次；
37 0.5×SSC  ℃ 洗涤15 分钟×1 次; 37 0.2×SSC  ℃ 洗涤15 分钟×1 次(如果有非特异
性染色，重复0.2×SSC 洗涤15 分钟×1-2 次)。
10.滴加封闭液：37 30  ℃ 分钟。甩去多余液体，不洗
11.滴加化鼠抗地高xin：37  60  ℃ 分钟或室温120 分钟。原位杂交用PBS 洗
5 分钟×4 次。
勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
12.滴加SABC：37 20  ℃ 分钟或室温30 分钟。原位杂交用PBS 洗5 分钟×3 次。勿
用其它缓冲液
和蒸馏水洗涤。
13.滴加化过氧化物酶：37 20  ℃ 分钟或室温30 分钟。原位杂交用PBS 洗5
分钟×4 次。
14.DAB 显色：使用DAB 显色试剂盒—1ml 蒸馏水加显色剂Ａ，Ｂ，C 各一滴，
混匀，加至标本上。一般显色20-30 分钟。若无背景出现则可继续显色。也可自配
DAB 显色剂后显色。充分水洗。
15.必要时苏木素复染，充分水洗。
16.酒精脱水，二甲苯透明，封片。
二．石蜡切片
如果有条件的话，应尽可能地采用新鲜标本。标本离体后，及时予以固定。固定
液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS（PH7.0-7.6），含有1/1000 DEPC。标本较大时用
刀片切成厚度不超过4mm 的小块，固定1 小时即可，较大的标本固定不要超过
2 小时。某些组织对过度固定尤其敏感，如动物大脑，固定时间 30-40 分钟，一
般不要超过1 小时。
1． 常规脱水、浸蜡、包埋。切片厚度6-8μm。
2． 玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或APES。
3． 石蜡切片经常规脱蜡至水。30%H2O2 1 份+蒸馏水10 份混合,室温5-10 分钟
以灭活内源性酶。蒸馏水洗3 次。
4．暴露mRNA 核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶（1ml 3%
柠檬酸加2 滴浓缩型胃蛋白酶，混匀），37℃或室温消化3--30 分钟（视标本
新旧、厚薄自行调整）。用户可以比较不同的消化时间，例如5 分钟,10 分钟，203
分钟，30 分钟。以找到*的消化时间。原位杂交用PBS 洗3 次×5 分钟。蒸馏水
洗1 次。其余步骤和冰冻切片6-16 步相同。
结果观察：il-6mRNA 的细胞胞浆着色呈棕黄色。
原位杂交的注意事项
原位杂交成套试剂盒，由于采用标记的探针和敏感性加强型原位杂交检测
试剂盒；使得原位杂交实验的成功率大大提高，操作也更简便。 但仍有一些问题
是引起注意的；
1、有条件应尽可能用新鲜标本，并及时进行固定。固定液为 4%多聚甲醛
(0.1MPBS，PH7.0-7.6)含0.1%DEPC。因为mRNA类基因容易降解。
2、标本的消化对原位杂交比较重要，适当的消化将使靶基因充分暴露，增加探
针的接触性。但过度的消化将使标本明显减薄乃至消失。不同的标本对消化的敏
感性不同。 常用的消化酶有蛋白酶K和胃蛋白酶。大量标本实验前，应仔细摸索
*的消化条件。蛋白酶K的消化条件为10ug/mL(0.1M TBS,PH7.2-7.6)，37℃
消化1-5分钟。
3、杂交后的洗涤对信号/背景/强度有密切关系，洗涤时间越短，信号越强，背景
也越高；洗涤时间超长，信号越低。适当的洗涤时间会获得理想的信号强度和可
以忽略的背景染色。