己糖激酶（hexokinase，HK）试剂盒说明书

己糖激酶(hexokinase，HK)试剂盒说明书   
分光光度法  50 管/48 样 
测定意义 
HK（EC 2.7.1.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是葡萄糖分解过程中的第
一个关键酶，催化葡萄糖转化为 6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖是糖酵解和磷酸戊糖途径的交
叉点。 
测定原理 
HK 催化葡萄糖合成6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖脱氢酶进一步催化 6-磷酸葡萄糖脱氢生成
NADPH，NADPH 在 340nm有特征吸收峰。 
需自备的仪器和用品 
紫外分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL石英比色皿、研钵、冰
和蒸馏水。 
试剂的组成和配制 
提取液：60mL×1瓶，4℃保存；   
试剂一：液体30mL×1瓶，  4℃保存； 
试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存；临用前加入 30mL蒸馏水充分溶解备用； 
试剂三：液体5 mL×1瓶，4℃保存； 
试剂四：粉剂×1 支，-20℃保存，临用前加入 4mL蒸馏水充分溶解备用； 
试剂五：粉剂×1 支，-20℃保存；临用前加入 2mL蒸馏水充分溶解备用； 
试剂六： 粉剂×1 支， -20℃保存； 临用前加入 250μL试剂一和 250μL蒸馏水充分溶解备用；  
样本的前处理 
1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量
（104
个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500万细菌或细胞加入 1mL提
取液） ，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声 3s，间隔10s，重复30 次）；
8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 
2、组织：按照组织质量（g） ：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g组织，
加入 1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 
3、血清（浆）样品：直接检测。 
测定步骤 
1、 分光光度计预热 30min以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。 
2、 将试剂一、二、三、四和五 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)预热10 分钟。 
3、 加样表： 
试剂名称（μL）  测定管 
试剂一  400 
试剂二  400 
试剂三  80 
试剂四  80 
试剂五  40 
试剂六  8 
样本  30 
将上述试剂按顺序加入 1 mL石英比色皿中，立即混匀，加样本的同时开始计时，在 340 nm
波长下记录 20秒时的初始吸光度 A1和 5 分 20秒时的吸光度 A2，计算 ΔA=A2-A1。 注意事项 
1、如果一次性测定样本数较多，可将试剂一、二、三、四、五和六按比例配成混合液，预
热 10min。 
2、不同匀浆组织中 HK 活力不一样，做正式试验之前请做1-2只预试，若 ΔA>0.5，则说明
组织活力太高，必须用提取液稀释成适当浓度匀浆上清液（计算公式中乘以相应稀释倍数），
或缩短反应时间至 2min,使 ΔA<0.5，以提高检测灵敏度。 
HK活性计算 
1、血清（浆）HK 活性 
单位的定义：每毫升血清（浆）在每分钟生成 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。 
HK（U/mL）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109
]÷V样÷T=1113×ΔA 
2、组织、细菌或细胞中HK 活性 
（1）按样本蛋白浓度计算 
单位的定义：每 mg组织蛋白每分钟生成1 nmol的 NADPH 定义为一个酶活力单位。 
HK（U/mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109
]÷(V样×Cpr) ÷T=1113×ΔA÷Cpr 
（2）按样本鲜重计算 
单位的定义：每 g组织每分钟生成 1 nmol的 NADPH 定义为一个酶活力单位。 
HK（U/g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109
]÷(W ×V样÷V样总) ÷T=1113×ΔA÷W 
（3）按细菌或细胞密度计算 
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。 
HK（U/104
 cell）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109
]÷(500×V样÷V样总) ÷T=2.226×ΔA 
V反总：反应体系总体积，1.038×10-3
 L；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×103
 L / mol /cm；
d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.03 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；
T：反应时间，5  min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细
胞总数，500万。