细胞AMP含量试剂盒检测HPLC法

细胞.植物AMP含量试剂盒检测HPLC法测定意义： 
AMP广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是描述细胞能量代谢状态的主要参数。
测定 AMP含量并且计算能荷，能够反映能量代谢状态。 
测定原理： 
AMP在 254 nm下有吸收峰，可以利用液相色谱法测定其含量。 
需自备的仪器和用品： 
液相色谱仪、低速离心机、溶剂抽滤装置、针头式过滤器（水系，50个，0.22μm）、滤
膜（水系和有机系各1 个，0.45μm）、C18 柱（4.6 ×150 mm）、可调式移液器、样品瓶（50
个，2mL）、甲醇（色谱级，300 mL）和蒸馏水。 
试剂的组成和配制： 
试剂一：液体60mL×1瓶，4℃保存； 
试剂二：液体60mL×1瓶，4℃保存； 
试剂三：粉剂1×1 瓶，粉剂 2×1瓶，4℃保存；临用前用少量蒸馏水将粉剂 1 和粉剂2 溶解
后倒入 1000mL容量瓶中，用蒸馏水定容至 1000mL，形成流动相缓冲液基质（注：试剂瓶
中的粉剂要冲洗干净）, 4℃可保存 1 周； 
试剂四：AMP标准品 5mg×1 支，-20℃保存； 
实验前的准备工作： 
1、将蒸馏水1000 mL、流动相缓冲液基质 1000 mL 和甲醇 300 mL用 0.45 μm的滤膜抽滤，
以除去溶剂中的杂质，防止堵塞色谱柱。（注：蒸馏水和缓冲液基质用水系滤膜抽滤，甲醇
用有机系滤膜抽滤）。 
2、流动相的配制：将抽滤完毕的流动相缓冲液基质 1000 mL与甲醇配比为 99.9：0.1（v/v），
即取 999mL缓冲液基质与 1mL甲醇混合。 
3、将抽滤完毕的甲醇和蒸馏水配比成 99%的甲醇，  10%的甲醇，蒸馏水各 250 mL。 
将 2 和 3 中的溶剂超声20 分钟，以脱去溶剂中的气泡，防止堵塞色谱柱。 
AMP的提取： 
1、组织的处理：按照组织质量（g） ：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约0.1g
组织，加入1mL试剂一），进行冰浴匀浆，4000g常温离心 15 min，取上清液，加入等体积
的试剂二，混匀，4000 g常温离心 15 min，取上清，针头式过滤器过滤后待测。 
2、细胞或细菌的处理：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数
量（104
个）：试剂一体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议500 万细菌或细胞加入 1mL
试剂一） ，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30
次）；4000  g  常温离心15  min，取上清液，加入等体积的试剂二，混匀，4000  g常温离心
15 min，取上清，针头式过滤器过滤后待测。 
标准品的配制： 
在试剂四中加入 1mL蒸馏水，配成 5mg/mL 母液，将母液用蒸馏水分别稀释成 100 μg/mL、
80μg/mL、60μg /mL、40 μg /mL和 20 μg /mL的 AMP标准品溶液。针头式过滤器过滤后待
测。 
AMP含量测定操作步骤： 
1.  开启电脑、检测器和泵，安装上色谱柱，打开软件，在方法组中设置进样量 20 μL，流速
1 mL/min，保留时间 10min，检测波长 254nm，设置完毕保存方法组。 
2.  用 99%的甲醇、10%的甲醇、蒸馏水按甲醇浓度从大到小的顺序过色谱柱30min。 
3.  用流动相过柱子，待基线稳定后开始加样。 
4.  加入标准品 20  μL，在 10min内可分离 AMP，  AMP的保留时间在7min左右，（柱子不
同，保留时间有差异），计算不同浓度的AMP标准品的峰面积。 
5.  加入样品20 μL，在相应保留时间处检测 AMP的峰面积。 
AMP含量的计算： 
以标准品浓度（μg/mL）为横坐标，峰面积为纵坐标计算 AMP 标准曲线。将样品峰面积代
入标准曲线，计算样品 AMP含量。 
细胞.植物AMP含量试剂盒检测HPLC法注意事项： 
1、 为了避免使用过程中柱压过大，流速由小到大调节。 
2、 使用完毕时，由于流动相含有缓冲盐，用水冲洗柱子1 小时，以防止缓冲盐结晶堵塞色
谱柱，然后用 10%的甲醇、99%的甲醇按甲醇浓度从小到大的顺序洗色谱柱30min。 
3、标准品的稀释倍数要根据样品中 AMP浓度确定，样品中 AMP的峰面积必须落在不同浓
度的 AMP标准品的峰面积之内，该标准品稀释倍数只是一个参考。 
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