线粒体复合体Ⅳ试剂盒紫外检测法

线粒体复合体Ⅳ试剂盒紫外检测法正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定 
测定意义： 
线粒体复合体Ⅳ又称细胞色素 C 氧化酶，也是线粒体呼吸电子传递链主路和支路的共有成
分，负责催化还原型细胞色素 C的氧化，并zui终把电子传递给氧，生成水。 
测定原理： 
还原型细胞色素 C在 550nm有特征光吸收，线粒体复合体Ⅳ催化还原型细胞色素 C生成氧
化型细胞色素 C，因此 550nm光吸收下降速率能够反映线粒体复合体Ⅳ酶活性。 
需自备的仪器和用品： 
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸
馏水。 
线粒体复合体Ⅳ试剂盒紫外检测法试剂的组成和配制 
试剂一：25mL×1瓶，-20℃保存； 
试剂二：  5mL×1瓶，-20℃保存； 
试剂三：0.5 mL×1瓶，-20℃保存； 
试剂四：液体10mL×2 瓶，4℃保存； 
试剂五：粉剂×2 支，-20℃保存； 
试剂六：粉剂×2 支，-20℃保存； 
样本的前处理： 
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离： 
1、 准确称取 0.1g组织或收集 500万细菌或细胞，加入1mL试剂一和 10uL 试剂三，用冰
浴匀浆器或研钵匀浆。 
2、 将匀浆 600g，4℃离心5min。 
3、 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心 10min。 
4、 上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅳ（此步可选
做） 。 
5、 步骤④中的沉淀即为线粒体，加入 200uL试剂二和 2uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，
功率 20％或200W，超声 3s，间隔 10秒，重复30 次），用于复合体Ⅳ酶活性测定。 
测定步骤： 
1、 分光光度计预热 30min以上，调节波长至 550nm，蒸馏水调零。 
2、 样本测定 
（1）工作液的配制：临用前取试剂四、试剂五、试剂六各一支，将试剂五和试剂六依次转
移到试剂四中混合溶解。分批配制工作液是为了防止当天不能测完，导致工作液失效。 
（2）将工作液置于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）孵育 5min；用不完的试剂 4℃
可保存一周； 
（3）在 1mL玻璃比色皿中加入40μL样本和 800μL工作液，立即混匀，记录 550nm处初
始吸光值 A1和  1min后的吸光值 A2，计算 ΔA=A1-A2。 
注意点： 若 ΔA大于 0.2， 需将样本用试剂二稀释适当倍数 （计算公式中乘以相应稀释倍数） ，
使 A1-A2小于 0.2，可提高检测灵敏度。  
复合体Ⅳ活力单位的计算： 
（1）  按样本蛋白浓度计算 
单位的定义：每 mg组织蛋白每分钟催化降解 1 nmol  还原型细胞色素 C定义为一个酶活力
单位。 
  复合体Ⅳ活力(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109
]÷(V样×Cpr) ÷T=1099×ΔA÷Cpr 
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。 
（2）  按样本鲜重计算 
单位的定义：每 g组织每分钟催化降解1nmol  还原型细胞色素 C定义为一个酶活力单位。 
  复 合 体 Ⅳ 活力 (nmol/min/g  鲜 重 )=[ΔA×V 反 总÷（ ε×d） ×109
]÷(W×  V 样 ÷V 样
总)÷T=222×ΔA÷W 
（3）  按细菌或细胞密度计算 
线粒体复合体Ⅳ试剂盒紫外检测法单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟催化降解 1nmol 还原型细胞色素 C 定义为一个酶
活力单位。 
复合体Ⅳ活力(nmol/min/104
 cell)=[ΔA×V反总÷ （ε×d） ×109
]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.444×ΔA 
V反总：反应体系总体积，8.4×10-4
 L；ε：细胞色素 C摩尔消光系数，1.91×104
 L / mol /cm；
d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.04 mL；V样总：加入提取液体积，0.202 mL；
T：反应时间，1  min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细
菌总数，500万。 
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