美国REAGEN™B1酶联免疫反应试剂盒

REAGEN^™黄曲霉毒素B1酶联免疫反应试剂盒

1．概述

B1酶联免疫反应测试盒是用于检测谷类，饲料，肌肉，牛奶，花生和阿月浑子（开心果）中B1的残留。该试剂盒特点包括：

• 高回收率（80-105%），快速（10-40分钟）。
• 高灵敏度（0.05ng/g或ppb）
• 高重现性。
• 快速的ELISA检测方法（在不考虑样品数量下只需不到2小时）。

2．试剂盒原理

REAGEN^™B1酶联免疫反应测试盒基于竞争性酶联反应原理，抗原已经包被于微孔板上。分析时，样品同一抗加入孔中，如果样品中含有毒素，会竞争抗体，因而抑制板上包被的毒素与抗体结合。HRP标记的二抗，与结合在板上一抗相结合后，加入TMB底物，底物的颜色显色强度与样品中毒素的含量成反比。

3.试剂盒组成

本试剂盒应当在2-8℃的温度下储存，有效期为一年。如果一个月内不使用试剂盒，黄霉

素毒素B1标准品，一抗和1×HRP-二抗应置于-20℃或者冷冻保藏。

4.检测限

5.交叉反应

6．其他需要而本试剂盒未提的设备或材料

• 酶标仪(450nm)
• 恒温培养箱
• 匀质器
• 漩涡振荡器
• 微量加样器(10、20、100和1000mL各一支)
• 多道枪：50-300mL
• 甲醇

7.注意事项

实验前请阅读以下文字，以保证获得实验效果。

• 标准品中含有B1，请小心使用。
• 不要使用过期的试剂盒。
• 不同批次的试剂盒不要混用，抗体和微孔板具有盒与批次的特异性。确保二抗及二抗稀释液正确配制。
• 尽量保持室温20-25℃，避免在通风口操作防止温度过低，过热和/或者蒸发。同样的，不要在阳光直射下实验，防止过热及蒸发。在孵育期间，如果工作台温度过低，应该铺垫若干纸巾或者其他物料。
• 水质量很重要，确保使用蒸馏或者去离子水。
• 加入样品或者试剂到空的微孔板时，吸嘴靠于微孔接近底部，并保持接触。
• 孵育时间的计算越规范越好，保持添加标准品的一致性，先添加标准品后添加样品。
• 从低浓度到高浓度地添加标准品，降低影响标准品曲线质量的风险。
• 将微孔板置于放有干燥剂的密封袋中，冷藏保存。

8．样品的准备

    样品保存在2-4℃不超过1-2天，如果需要保存较长的时间，应该放置-20℃。样品使用前应恢复到室温。

1） 干肉/鱼，谷类，饲料，种子

• 研磨并混匀适量的样品；
• 称取5g磨碎的样品，放入适当的容器中；
• 加入25mL70%甲醇，用手或者振荡器剧烈振荡20分钟；
• 室温（22.5±2.5）°C下4000 rpm离心10分钟；
• 取1mL上清液，加入1mL蒸馏水或者去离子水稀释；
• 取50μL作检测。

稀释倍数：10

备注：如果需要，样品所取的量可以增加，同时甲醇/水的用量也必须作相应的改变。例如取10g样品，应该加入50mL70%甲醇。如果样品中含量很高，那么样品必须经过稀释，请用35%甲醇进行稀释。 

2）肌肉/肝脏/肾脏

• 研磨并混匀适量的样品；
• 称取5g磨碎的样品，放入适当的容器中；
• 加入25mL70%甲醇，用手或者振荡器剧烈振荡20分钟；
• 室温（22.5±2.5）°C下4000 rpm离心10分钟；
• 取1mL上清液，加入1mL蒸馏水或者去离子水稀释；
• 取50μL作检测。

稀释倍数：10

备注：如果需要，样品所取的量可以增加，同时甲醇/水的用量也必须作相应的改变。例如取10g样品，应该加入50mL70%甲醇。如果样品中含量很高，那么样品必须经过稀释，请用35%甲醇进行稀释。

3）花生酱

（1）  研磨并混匀适量的样品

（2）  称取2g匀质的样品，放入适当的容器中

（3）  加入4mL35%甲醇，用手或者振荡器剧烈振荡20分钟

（4）  室温（22.5±2.5）°C下4000 rpm离心10分钟

（5）  取50μL作检测

   稀释倍数：3

4）牛奶

（1）.脱脂牛奶：用35%甲醇按1：9的比例稀释牛奶样品（20ul牛奶+180ul35%甲醇），取50ul稀释样品以待检测

（2）.含脂牛奶：取适量样品，室温（22.5±2.5）°C4000g离心5min，弃去上层脂肪层，用35%甲醇按1：9的比例稀释牛奶样品（20ul牛奶+180ul35%甲醇），取50ul稀释样品以待检测

稀释倍数：10

5）蔬菜/豆类/花生/橄榄油

      （1） 称取0.5g样品，加入2.5ml35%的甲醇。

    （2） 涡流10分钟或高速涡流3分钟,静置2分钟

   （3） 去掉上层脂肪液，取50μL下清液作检测

    稀释倍数：5

9．酶联免疫反应测试步骤

试剂准备

注意：试剂在使用之前要在室温下解冻1-2小时，确定在使用前阅读过注意事项。准备适量的检测用试剂，所有的试剂摇匀后使用。准备足够所有小管所需的用量，不能将试剂倒回原来的瓶子中，处理试剂时建议用废弃的瓶子以降低污染的风险。

1x洗液的制备

1体积的20x洗液同19体积的蒸馏水混合

检测

以下为计算份量的表格，用户可根据自己的需要来确定需要配置多少试剂。

• 加入50mL的标准液于所设定的孔中；
• 加入50mL的样品于所设定的孔中
• 在每孔中加入100mL一抗， 轻敲微孔板边缘混匀60秒；
• 室温（22.5±2.5）°C避光孵育30分钟

洗板3次，每次加入250mL 1×洗液，zui后一次尽量甩干并在吸水纸上吸干；

• 每孔加入150mL 1×二抗工作液，室温（22.5±2.5）°C避光孵育30分钟

洗板3次，每次加入250mL 1×洗液，zui后一次尽量甩干并在吸水纸上吸干；

• 每孔加入100mL的TMB底物，用手敲板边缘1分钟混合均匀；
•  室温（22.5±2.5）°C避光孵育15分钟， 加入100mL的终止液终止反应。
•  在450nm下读OD值(读数前，用无绒布擦拭除去微孔底部的水分和指痕)。

10．结果计算

• 分别计算标准、质控和样品的平均吸光度值和相对吸光度值。
• 相对吸光度值 (%) = (标准或样品吸光度值/零标准吸光度值) ´ 100
• 以相对吸光度值为纵坐标，标准浓度为横坐标建立标准曲线。

• 从标准曲线上读取质控和样品的浓度值。
• 样品检测下限和定量下限计算方法如下：

样品检测下限 = (0.05ng/g) ´ (稀释倍数)

样品定量下限 = (0.1ng/g) ´ (稀释倍数)

   备注：如结果呈阳性反应，应该用其他检验方法（如色谱/质谱方法等）进行确证。以下曲线图是B1酶联免疫反应测试盒的典型标准曲线