壬基酚ELISA农残试剂盒_美国ABRaxis原装试剂盒

壬基酚ELISA农残试剂盒_美国ABRaxis原装试剂盒 壬基酚 ELISA 试剂盒用户操作指南 货号PN590012
（请以英文为准，中文仅供参考）
壬基酚ELISA农残试剂盒_美国ABRaxis原装试剂盒 一、有限的保证
Japan EnviroChemicals,Ltd. (the Company, hereunder)保证此产品是按相关规定生产的在材料上没有任何问题。这个保证书规定：对于问题产品原价赔偿或用新的产品替换问题产品。用户要在收到产品30天内向公司提出书面报告，过期不候。另外，这份保证书仅适用于正常使用产品，如果是由于用户的粗细大意，失误或不合理的使用造成的问题，本公司概不负责。
产品的设计在不断的改进，我们将会对说明书做出相应的修改，对此我们将不会提前通知。
二、试剂盒特点 
?AP单克隆抗体特异地与AP结合，和其它结构相类似的化学物质不发生交叉反应。单克隆抗体质量稳定每批次见几乎没有变化。
?检测范围5μg/L - 500μg/L (ppb) 。通过固相萃取浓缩可以检测更低的浓度。
?这个试剂盒有很高的重复性，变异系数在10%之内。
?操作简单，整个过程仅花费2.5小时
?试剂盒的形式是96孔微孔板，可以同时检测多个样品，花费合理。
三、检测原理 （竞争ELISA）
1. 竞争性反应 
这个检测方法依靠单克隆抗体来识别AP。样品中的AP和一个AP-酶结合物预先混合然后加入到每个微孔中竞争包被在微孔表面的特异性抗体。样品中AP的浓度如果高于AP-酶结合物，AP将主要与抗体结合。反之样品中AP的浓度如果低于于AP-酶结合物，AP-酶结合物将主要与抗体结合。
2. 显色反应 
通过洗涤步骤去除没有反应的AP和过多的AP-酶结合物。通过加入底物来检测AP。和微孔板中抗体结合的AP-酶结合物催化底物发生反应产生有色物质。通过一个孵育期用稀酸终止反应。样品中AP的浓度越高导致结合到微孔板抗体上的AP-酶结合物越少，从而产生的颜色越淡，吸光度越低。
3. 定量分析 
利用已知浓度的AP标准的浓度和在450nm条件下获得的吸光度值做出一条剂量反应曲线（标准曲线）。把样品的吸光度值用内插法插入到标准曲线中可以的计算出样品中AP的浓度。
四、AP 检测流程
1.样品处理
在操作前半小时从冰箱中拿出试剂盒使其恢复到室温（18-25°C）。过滤样品，加入甲醇和DMSO使甲醇的zui终浓度为10% (v/v),DMSO的zui终浓度为1%(v/v)。对于一些样品进行固相萃取是必要的。
2. 标准溶液
利用甲醇溶液（甲醇：水 0.8：8.2）把AP标准浓缩液稀释10倍。然后对此溶液进一步稀释成设定的AP标准的浓度（5μg/L- 500μg/L）。在配制的时候先加甲醇溶液后加标准。
3. 抗原-酶结合物溶液
重新配制一瓶抗原-酶结合物溶液：抗原-酶结合物粉末(#3) + 缓冲液(#4, 白盖).
4. 标准/样品 与结合物混合
在没有包被的微孔板中(#8)混合100μL AP标准（或样品）和100μL酶结合物溶液。先加结合物后加标准或样品。
5. 竞争反应
在包被抗体的微孔板(#1)的每个孔中加入100μL在第四步中混合的溶液，在室温(18-25°C)孵育60分钟。
6. 洗液
用蒸馏水以1：5的比例稀释洗液（6倍浓缩）：1ml 洗液(#5) + 5ml蒸馏水 
7. 没有结合的物质
每个微孔用300μL的洗液冲洗，并重复两次。在吸水纸上用力的排板出去微孔中的液体。
8. 显色
每个微孔加入100μL显色试剂(#6, 棕色瓶)，在室温(18-25°C)孵育30分钟。然后加入每孔再100μL的终止液(#7, 黑盖)终止反应。
10. 定量
在450nm测定每个标准的吸光度值制作标准曲线。利用内插法把样品的吸光度值代入标准曲线计算样品中AP的含量。

壬基酚ELISA农残试剂盒_美国ABRaxis原装试剂盒 五、所需材料
1、试剂盒组成
#     Contents     体积    数量     储存
1     MoAb-Coated Microplate  单抗包被微孔板    96 Wells     1 Plate     2-8°C 
2     AP Standard 0μg/L (10%DMSO 20%MeOH)
AP Standard 50μg/L (10%DMSO 20%MeOH)
AP Standard 200μg/L (10%DMSO 20%MeOH)
AP Standard 1000μg/L (10%DMSO 20%MeOH)
AP Standard 5000μg/L (10%DMSO 20%MeOH)    1.5mL/瓶     1瓶/种     2-8°C 
3     Antigen-enzyme Conjugate 抗原-酶结合物粉末        2 Vials     2-8°C 
4     Buffer Solution – white cap – 缓冲液-白盖    7mL     2 Vials     2-8°C 
5     Wash Solution (6-fold concentration) 洗液（6x浓缩）    50mL     1 Vial     2-8°C 
6     Color Solution 显色液（棕色瓶）
- brown vessel -    15mL     1 Vial     2-8°C 
7    Stop Solution – black cap – 终止液-黑盖    15mL     1 Vial     2-8°C 
8     Uncoated Microplate 没有宝被抗体微孔板    96 Wells     1 Plate     --- 
9    Plate Cover 微孔板盖    ---     1     --- 
10    说明书        1    
2、其它必须试剂/材料
1）必需 – 样品浓缩时不需要
?一次性玻璃试管(e.g. IWAKI, item No. 9831-1207)确保要使用一次性试管避免AP的吸附作用
?玻璃纤维滤器(e.g. ADVANTEC Co., item No. 36481047 Φ47mm)和过滤设备
?微量加液器(20μL - 200μL 和100μL - 1000μL, e.g. Gilson Pipetman P-200, P-1000)和吸头
(e.g. ICN Superpack 96NS)
?排枪(50μL - 300μL)
?酶标仪（450nm波长）(e.g. TECAN Sunrise Remote)
?计时器
?Strip ejector (e.g. COSTAR, No.2578) 
?甲醇Methanol (HPLC grade) 
?DMSO(HPLC grade)
2）必需- 通过SPE 浓缩时需要
?以上的材料都需要,再加上下面的材料
?固体萃取柱(e.g. NEXUS SPE Cartridge Producer: VARIAN PART#:1210-3102 ABS ELUT- NEXUS, 200MG 6ML,30/PK)
?丙酮(HPLC grade)
?二氯甲烷(analytical reagent)
3、重要性
如果在试验过程中使用一些没有使用过的厂家生产的产品试剂时需要做比较试验。 
六、检测步骤
重要性 
?仅用于研究、不用于个人 
?在操作前半小时从冰箱中拿出试剂盒使其恢复到室温（18-25°C）。
?不同试剂盒的中的试剂不要混用
?储存在2-8 °C
?不使用过期产品
?使用完试剂盒后根据当地的法规处理废液。
?为了增加准确性在检测中做两个重复。
注意
在试验中要穿保护性衣服，戴手套和眼镜保证和试剂盒中的液体接触。
1．样品前处理
利用特定的玻璃纤维滤纸(1μm 孔径)过滤水样，加入DMSO和甲醇使DMSO终浓度为1% (v/v)、甲醇终浓度
为10% (v/v)。如果滤液要求浓缩和清洗需要固相萃取。
例子
1）将上面制备滤液过NEXUS cartridge柱（已经用二氯甲烷(ex. 10ml)、甲醇(ex. 5ml)、蒸馏水(ex. 5ml)提前处理好的），流速10mL/min
2）用蒸馏水(ex. 5ml)和50%蒸馏水/甲醇(ex. 5ml)洗柱。真空干燥柱不超过45分钟。
3）用二氯甲烷(ex. 6ml)洗脱分析物、然后用氮气（在30摄氏度或更低的温度）吹干。
4）加入甲醇和DMSO溶液溶解残留物，调节溶液的终浓度到1%DMSO和10%甲醇溶液。
2.  标准溶液
制备甲醇溶液（甲醇：蒸馏水=0.8 ml/8.2ml）以备稀释标准(#2, 10% v/v DMSO, 20% v/v
methanol)使用。利用上面制备的甲醇溶液以1：9的比例稀释AP标准(#2)来配制设定的AP标准溶液(1% v/v DMSO, 10% v/v methanol)。

1）在配制标准溶液的过程中先加甲醇溶液后加标准(#2)。这样可以减少AP对试管壁的吸附。
2）使用一次性玻璃试管来稀释标准，可以减少吸附和污染。
3）如果不经过10倍稀释储存液的步骤直接稀释到设定的标准溶液的浓度，那么标准的真实浓度将要比计划的浓度要大，所测定的吸光度的值要小0.2-0.5。确保要先稀释10倍。
4）在测定前制备AP标准溶液，一旦标准溶液从浓缩的状态稀释后就不再稳定了，不易保存很长时间。每个检测过程都要配制新的标准溶液。
5）用移液器吸头混匀，不要涡旋震荡器用剧烈震荡来减少样品中AP对试管壁表面的吸附。
6）在使用完之后要确保标准浓缩液的盖拧紧并放在冰箱，标准溶液必须被密封或把盖拧紧以免甲醇挥
发。
7）保证标准溶液中甲醇的浓度为10%。过高的甲醇浓度可以损害抗体，太低的浓度导致结果读数不正确。
8）不要随意处理试验废液，要按当地的法规来处理。
3. 抗原-酶结合物
重新配制一瓶抗原-酶结合物溶液：抗原-酶结合物粉末(#3) + 7ml缓冲液(#4, 白盖)。
?配制好的溶液要储存在2-8°C，可以稳定地保存2周。
?7mL足够50个孔使用。
?用移液器吸头混匀，转移液体时不要产生气泡。
?在使用的时候配制。
4. 标准/样品 与结合物混合
在没有包被抗体的微孔板中(#8)加入100ul酶结合物溶液，然后再加入100ul在第二步中配制的AP标准溶液或100μL样品（制备的1% (v/v) DMSO 和10 % (v/v) 的甲醇溶液）。用移液器吸头混匀。
?首先加入结合物溶液然后加入标准或样品避免孔的内表面的非特异性吸附。
?用移液器吸头混匀，转移液体时不要产生气泡。
?用1% DMSO 和10%的甲醇溶液做一个空白。
5. 竞争反应 
在包被抗体的微孔板(#1)的每个孔中加入100μL在第四步中混合的溶液，轻轻是震荡微孔板使其内部的液体混匀，在室温(18-25°C)孵育60分钟。
?包被抗体的酶标板共有12条，每条有8个孔，在检测前取出所需的孔。然后把不用的再重新放好。
?在转移液体时要确保不产生气泡，因此操作要轻。
?用胶带覆盖微孔板避免污染和液体挥发。
?在反应期间不要移动和振动微孔
?温度控制在18-30°C
?严格反应时间
6. 洗液 
用蒸馏水以1：5的比例稀释洗液（6倍浓缩）(#5)：20ml 洗液(#5) + 100ml蒸馏水 。每次检测配制所需体积的溶液，每个孔每次要求1.2mL的洗液，整个板需要120 mL。洗液要保存在2-8°C，在配制后大约可以稳定保持一个月的时间。
7. 没有结合的试剂 
每个微孔用300μL的洗液冲洗，并多重复两次。在吸水纸上用力的拍板除去微孔中的液体。
?要确保除去任何液体，否则可能引起测量错误。
?确保微孔板底部干净，不要有手印或其它污垢，否则吸光度将有很大改变。
?不要倾倒任何没有处理的废液，例如：浸泡的布或纸要燃烧掉。
8. 显色反应
在每个微孔中加入100ul显色液(#6, brown vessel)。在室温下孵育30min。然后每个微孔加入100ul终止液(#7,黑盖)终止反应。
?孵育温度控制在18-30°C
?要使每个孔的反应时间一致，尤其在测试多个样品的时候
?加入终止液后孔中的蓝色转变为黄色 
9. 定量 
在450nm用酶标仪测定每个标准和样品的吸光度值。
?在终止反应15分钟内测定吸光度值。
?每次检测制作标准曲线的标准至少做两个重复。
?确保微孔底面没有手印和污物，否则测定的吸光度值有很大的改变。
?样品的检测范围5μg/L - 500μg/L，样品中AP的浓度超过500μg/L时要用10%甲醇+1% DMSO稀释后再测定。对于*不知情的样品做前处理时要做远不止一倍的稀释。

计算样品中AP浓度的方法

（1）电脑计算
利用酶标仪分析软件，用Log-Log (or Log-Linear)曲线。
（2）利用附带的曲线图计算

X-axis : NP concentration
Y-axis : Optical Density(OD) or Inhibition Rate(B/B0%)
Inhibition Rate(B/Bo%) = (Sample or standard OD)/(OD at NP standard=0)

七、附件
1、排板上样设计
AP单克隆抗体包被的微孔板有96个孔，可以拆成8 x 12条
例1：全板格式
5个不同的AP标准(0, 5, 20, 100, 500μg/L),每个都做两个重复，共用去10个孔，还留有86个孔，每个样品做两个重复可以检测43个样品。

例2：部分板的格式
5个不同的AP标准，每个都做两个重复，共用去10个孔。半个板还有38个孔，每个样品做2个重复可以检测19个

2. AP 标准的化学结构

3 交叉反应

4. AP 标准曲线
样品中AP的浓度在5μg/L - 500μg/L范围内可以直接检测，样品中AP的浓度超过10μg/L时要用1% (v/v) DMSO and 10% (v/v) 稀释后再测定。样品中AP的浓度低于5μg/L时要用固相萃取浓缩后再测定。变异系数要小于10%。