REAGEN™酶联免疫反应测试盒

REAGEN™酶联免疫反应测试盒
RND99023
1． 概述
REAGEN™酶联免疫反应测试盒是利用竞争性的酶联反应原理，用于饲料、鱼、
虾和肉类组织（如鸡、牛肉和猪肉） ，鸡蛋、蜂蜜、牛奶、血清和尿样中（SEM）残留
的定量检测。检测肉样时该试剂盒的前处理方法可作为与AOZ、CAP、SEM、AHD五合一前处理方
法统一处理一个样品，同时检测几个项目。该试剂盒有以下特点：
? 高回收率(75%-105%)，多种样品的低成本提取方法。
? 高灵敏度（0.05ppb）；多样品低检测下限（虾/鱼/肉类0.1ppb）。
? 高重复性。
? 检测过程只需要不到1.5小时。
? 五合一处理方法更省时、经济、环保。
REAGEN™酶联免疫反应测试盒2．试剂盒原理
REAGEN™酶联免疫反应测试盒基于竞争性酶联反应原理，含有(SEM)
的抗体已经包被于微孔板上。药物分析时，样品同SEM-HRP 共同被添加到板孔中。如果样品中
含有SEM，会竞争 SEM 抗体，抑制 SEM-HRP 与板上包被的抗体结合。加入底物后，产物的颜色
强弱与样品中 SEM 的浓度成反比。
3. 试剂盒组成
已包被的酶标板（可拆式） 12×8 孔
标准液（0，0.025，0.1，0.4，1.6，6.4ppb） 6×2.0mL
回收用10ppb(Spiking)——可选 1×0.8ml
HRP酶标抗原(HRP-Conjugated) 1×6mL
10×样品提取液(Sample Extraction Buffer) 1×25mL
20×浓缩洗液(Wash Solution) 1×30mL
终止液(Stop Buffer) 1×20mL
TMB 底物(TMB Substrate) 1×10mL
50mM 2-硝基苯甲醛(2-Nitrobenzaldehyde) 1×1.8mL
本试剂盒应当在2-8℃的温度下储存，有效期为一年。如果超过 3 个月不使用试剂盒，
请将 SEM-HRP 酶标抗原放置-20℃或者冰冻保存。
REAGEN™酶联免疫反应测试盒4.检测限
检测物质 检测下限（ng/g）
饲料 0.1
鱼/虾/肉 0.05
鸡蛋/蛋粉 0.05
蜂蜜 0.05
牛奶 0.05
血清 0.05
尿样 0.05
5.交叉反应
交叉反应物质 交叉反应率（%）
SEM 99%
AOZ <0.04%
AHD <0.06%
呋喃咜酮 AMOZ <0.05%
6．未提供的设备或材料
1) 酶标仪(450 nm)
2) 恒温培养箱
3) 匀浆器
4) 蒸干器
5) 漩涡振荡器
6) 移液枪(50，100?L，1mL 各一支)
7) 多道移液器（50-300?L）第 2页 共4页
8) 乙酸乙酯
9) 0.1M K2HPO4
10) 正己烷
7.注意事项
实验前请阅读以下文字，以保证获得实验效果。
1) 标准品中含有，请小心使用。
2) 不要使用过期的试剂盒。
3) 不同批次的试剂盒不要混用，抗体和微孔板具有盒与批次的特异性。
4) 尽量保持室温 20-25℃，避免在通风口操作防止温度过低，过热和/或者蒸发。同样的，
不要在阳光直射下实验，防止过热及蒸发。在孵育期间，如果工作台温度过低，应该铺垫
若干纸巾或者其他物料。
5) 水质量很重要，确保使用蒸馏或者去离子水。
6) 加入样品或者试剂到空的微孔板时，吸嘴靠于微孔接近底部，并保持接触。
7) 孵育时间的计算越规范越好，保持添加标准品的一致性，先添加标准品后添加样品。
8) 从低浓度到高浓度地添加标准品，降低影响标准品曲线质量的风险。
9) 将微孔板置于放有干燥剂的密封袋中，冷藏保存。
8．样品的准备
确保样品的正确保存，一般来说，样品在2-4 只能保存1-2 天，如果要保存更长时间，就要保
存在-20冷冻保存，在用之前需要将冷冻的样品在室温下或冰箱内解冻。
1×样品提取液
按 1：9 的比例配制样品提取浓缩液和双蒸馏水。
1）饲料（用于检测添加到饲料中的鱼粉、虾粉或动物组织的 SEM）
（1） 取0.5g 匀质样品，加入 0.5mL1×样品提取液，3.5mL 蒸馏水，0.5mL 1M HCl和 20 µL
50 mM 2-硝基苯甲醛，涡旋振荡 1min；
（2） 50°C 恒温培养 3 小时，在培养期间，每 1h振荡 5 秒；
（3） 加入 5mL 0.1 M K2HPO4，0.4 mL 1 M NaOH，6 mL 乙酸乙酯，zui大转速涡旋震荡 1min；
（4） 室温下4000g 离心 10 分钟；
（5） 取3mL 乙酸乙酯上清液（含 0.25g 初始样品）到另一试管（避免触及下层水相！如果
移取液中含有水相，再次4000g 离心5 分钟，取上层有机相） ，在 60-70 °C 减压蒸馏
或 60-70°C 氮气吹干；
（6） 用 1 mL 正己烷(或者正庚烷)溶解干燥好的样品；
（7） 加入 1mL1×样品提取液，zui大转速涡旋振荡 2 分钟；
（8） 室温下 4000g 离心 10 分钟；
（9） 每孔取 100 µL 下清液，进行样品测试。
稀释倍数：4.0
2）鱼/虾/肉（牛肉/鸡肉/猪肉） ：可用于五合一前处理方法
（1） 称取 1g 匀浆样品加入0.5mL1×样品提取液， 3.5mL 蒸馏水， 0.5mL 1M HCl和 20µL50 mM
2-硝基苯甲醛，涡旋震荡 30 秒；
（2） 50°C 恒温培养 3h，培养期间，每 1h 振荡 5 秒；（说明书后的**标记方法可供选择）
（3） 加入 5mL 0.1 M K2HPO4，0.4 mL 1 M NaOH， 6 mL 乙酸乙酯，涡旋震荡振荡 30s；
（4） 室温下（20-25℃）4000g 离心 10 分钟；
（5） 取 3mL 上清液(包含了 0.5g的原始样品)到另一试管（避免触及下层水相！如果移取液
中含有水相，再次4000g 离心5 分钟，取上层有机相） ，如果出现乳化现象，上清液不
足 3mL，请 85℃水浴 3 分钟。在 60 -70°C 减压蒸馏或 60-70°C 氮气吹干；
（6） 用 1 mL 正己烷(或者正庚烷)溶解干燥好的样品；（注：肝脏组织富含脂肪、色素等，
为防止乳化现象，建议选用 4mL 正己烷溶解，涡旋震荡 30 秒后，再进行下一步操作）
（7） 加入 1mL1×样品提取液，剧烈振荡 1 分钟；
（8） 室温下 4000g 离心 10 分钟；
（9） 每孔取 100 µL 下清液，进行样品测试。
注意：为了避免过高的背景值，建议用空白样品做平行，从取 3ml乙酸乙酯上清旋转
蒸发开始。
稀释倍数：2.0
3）鸡蛋
（1） 称取 1g 鸡蛋样品加入0.5mL1×样品提取液，3.5mL 蒸馏水，0.5mL 1M HCL 和 20µL 50
mM 2-硝基苯甲醛，剧烈振荡 30秒；
（2） 50°C 恒温培养3 小时，在培养期间，每 1h 振荡5 秒；（说明书后的**标记方法可供
选择）
（3） 加入 5mL 0.1 M K2HPO4，0.4 mL 1 M NaOH， 6 mL 乙酸乙酯，涡旋震荡振荡 30s；
（4） 室温下 4000g 离心 10 分钟；
（5） 取 3mL 上清液(包含了 0.5g 的原始样品) 到另一试管（避免触及下层水相！如果移取第 3页 共4页
液中含有水相， 再次4000g离心5分钟， 取上层有机相） ， 在60-70℃减压蒸馏或60-70℃
氮气吹干；
（6） 用1 mL 正己烷(或者正庚烷)溶解干燥好的样品；
（7） 加入 1mL1×样品抽提工作液体，剧烈振荡 2 分钟；
（8） 室温下4000g 离心 10 分钟；
（9） 每孔取100µL 下清液，进行样品测试。
稀释倍数：2.0
REAGEN™酶联免疫反应测试盒注意：为了避免过高的背景值，建议用空白样品做平行，从取3ml 乙酸乙酯上清旋转
蒸发开始。
4）蜂蜜
（1） 称取1g 蜂蜜加入0.5mL1×样品提取液，3.5mL 双蒸水，0.5mL 1M HCL和 20µL 50 mM 2-
硝基苯甲醛，剧烈振荡 1 分钟；
（2） 50°C 恒温培养 3 小时；（说明书后的**标记方法可供选择）
（3） 加入 5mL 0.1 M K2HPO4，0.4 mL 1 M NaOH ， 6 mL 乙酸乙酯，zui大转速振荡 1min；
（4） 室温下4000g 离心 10 分钟；
（5） 取3mL 上清液(包含了 0.5g 的原始样品) 到另一试管（避免触及下层水相！如果移取
液中含有水相，再次 4000g 离心 5 分钟，取上层有机相） ，在 60 -70°C 减压蒸馏或
60-70°C 氮气吹干；
（6） 用1 mL 正己烷(或者正庚烷)溶解干燥好的样品；
（7） 加入 1mL1×样品提取液，剧烈振荡 2 分钟；
（8） 室温下4000g 离心 10 分钟；
（9） 每孔取100 µL 下清液，进行样品测试。
稀释倍数：2.0
5）牛奶
（1） 对于含脂牛奶，取待测牛奶样品 3ml 室温4000g，5min。除去上层脂肪层。 （对于脱脂
奶粉，次步略）
（2） 取1ml 样品，加入 0.5mL1×样品提取液，3.5mL 双蒸水，0.5mL 1M HCL 和 40µL 50 mM
2-硝基苯甲醛，剧烈振荡1 分钟；
（3） 50°C 恒温培养 3 小时；（说明书后的**标记方法可供选择）
（4） 加入5mL 0.1 M K2HPO4，0.4 mL 1 M NaOH，6 mL 乙酸乙酯，zui大转速振荡 1min；室
温下 4000g 离心 10 分钟；
（5） 取 3mL 上清液(包含了 0.5g 的原始样品) 到另一试管（避免触及下层水相！如果移取
液中含有水相，再次 4000g 离心 5 分钟，取上层有机相） ，在 60 -70°C 减压蒸馏或
60-70°C 氮气吹干；
（6） 用 1 mL 正己烷(或者正庚烷)溶解干燥好的样品；
（7） 加入 1mL1×样品提取液，剧烈振荡 2 分钟；
（8） 室温下 4000g 离心 10 分钟；
（9） 每孔取 100 µL 下清液，进行样品测试。
稀释倍数：2.0
6）血清
（1） 称取 1g 血清加入0.5mL1×样品提取液，3.5mL 双蒸水，0.5mL 1M HCL和 20µL 50 mM
2-硝基苯甲醛，剧烈振荡 1 分钟；
（2） 50°C 恒温培养 3 小时；（说明书后的**标记方法可供选择）
（3） 加入 5mL 0.1 M K2HPO4，0.4 mL 1 M NaOH ， 6 mL 乙酸乙酯，zui大转速振荡 1min；
（4） 室温下 4000g 离心 10 分钟；
（5） 取 3mL 上清液(包含了 0.5g的原始样品) 到另一试管（避免触及下层水相！如果移
取液中含有水相，再次 4000g 离心 5 分钟，取上层有机相） ，在 60 -70°C 减压蒸馏
或60-70°C 氮气吹干；
（6） 用 1 mL 正己烷(或者正庚烷)溶解干燥好的样品；
（7） 加入 1mL1×样品提取液，剧烈
（8） 振荡 2 分钟；
（9） 室温下 4000g 离心 10 分钟；
（10） 每孔取 100 µL 下清液，进行样品测试。
稀释倍数：2.0
7）尿样
（1） 取 3ml 尿样，4000g 离心 5min。
（2） 离心后称取 1ml，加入0.5mL1×样品提取液，3.5mL 双蒸水，0.5mL 1M HCL 和 40µL 50
mM 2-硝基苯甲醛，剧烈振荡 1 分钟；
（3） 50°C 恒温培养 3 小时；（说明书后的**标记方法可供选择）
（4） 加入 5mL 0.1 M K2HPO4，0.4 mL 1 M NaOH ， 6 mL 乙酸乙酯，zui大转速振荡 1min；第 4页 共4页
（5） 室温下4000g 离心 10 分钟；
（6） 取3mL 上清液(包含了 0.5g 的原始样品) 到另一试管（避免触及下层水相！如果移取
液中含有水相，再次 4000g 离心 5 分钟，取上层有机相） ，在 60 -70°C 减压蒸馏或
60-70°C 氮气吹干；
（7） 用1 mL 正己烷(或者正庚烷)溶解干燥好的样品；
（8） 加入 1mL1×样品提取液，剧烈振荡 2 分钟；
（9） 室温下4000g 离心 10 分钟；
（10） 每孔取100 µL 下清液，进行样品测试。
稀释倍数：2.0
10．检测步骤
试剂的准备
注意：试剂在使用之前要在室温下解冻 1-2 小时，确定在使用前阅读过注意事项。准备适量的
检测用试剂，所有的试剂摇匀后使用。准备足够所有小管所需的用量，不能将试剂倒回原来的
瓶子中，处理试剂时建议用废弃的瓶子以降低污染的风险。
1x 洗液的制备
1 体积的 20x洗液同 19 体积的蒸馏水混合
检测
\以下为计算份量的表格，用户可根据自己的需要来确定需要配置多少试剂。
试剂 每个反应需要的体积 24 次反应的体积
SEM-HRP 50 ?L 1.2mL
1×洗液 1mL 24 mL
终止液 100 ?L 2.4 mL
底物 100 ?L 2.4 mL
底物 100 ?L 2.4 mL
（1） 加入 100?L 的标准品于所设定的孔中；
（2） 加入 100?L 的样品于所设定的孔中
（3） 在每孔中加入 50?L 1×SEM-HRP，轻敲微孔板边缘混匀 1 分钟；
（4） 室温（22.5±2.5）°C 避光孵育 30 分钟；
（5） 洗板 3 次，每次应该加入 250?L 1×洗液，zui后一次使板尽量甩干并在吸水纸上吸干；
（6） 每孔加入 100?L 的TMB 底物；
（7） 在室温（22.5±2.5）°C 避光孵育 20 分钟后，每孔加入 100?L 的终止液终止反应;
（8） 在 450nm 或 450/650nm 下读 OD 值 (读数前，用吸水纸将板底部的指痕和水分擦去，避
免影响读数)。
10．结果计算
（1） 分别计算标准、质控和样品的平均吸光度值和相对吸光度值。
相对吸光度值 (%) = (标准或样品吸光度值/零标准吸光度值) ? 100
（2） 以相对吸光度值为纵坐标，标准浓度为横坐标建立标准曲线。
（3） 从标准曲线上读取质控和样品的浓度值。
（4） 样品检测下限计算方法如下：
样品检测下限 = (0.025ng/g) ? (稀释倍数)
样品定量下限 = (0.1ng/g) ? (稀释倍数)
例如，肉类样品的稀释倍数是 2.0,那么肉类样品的检测下限是 0.05ppb,定量检测下限是
0.2ppb。
以下曲线图是酶联免疫反应测试盒典型标准曲线