Annexin Ⅴ-FITC 细胞凋亡试剂盒说明书
一、测定意义：
Annexin 是一类广泛分布于真核细胞细胞浆内钙离子依赖的磷酯结合蛋白，参与细胞内的信
号转导。Annexin V 选择性结合磷酯酰*(phosphatidylserine，简称 PS)。磷酯酰*主
要分布在细胞膜内侧，即与细胞浆相邻的一侧。在细胞发生凋亡的早期，不同类型的细胞都会把
磷酯酰*外翻到细胞表面，即细胞膜外侧。磷酯酰*暴露到细胞表面后会促进凝血和炎
症反应。而 Annexin V 和外翻到细胞表面的磷酯酰*结合后可以阻断磷酯酰*的促凝血
和促炎症反应活性。因此 Annexin V 被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。用带有绿色荧光
的荧光探针 FITC 标记的 Annexin V，即 Annexin V-FITC，就可以用流式细胞仪或荧光显微镜非常
简单而直接地检测到磷酯酰*的外翻这一细胞凋亡的重要特征。
Annexin V-FITC 细胞凋亡测剂盒(Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit)是用 FITC 标
记的重组人 Annexin V 来检测细胞凋亡时出现在细胞膜表面的磷酯酰*的一种细胞凋亡检测
试剂盒。可以使用流式细胞仪、荧光显微镜或其它荧光检测设备进行检测。
本试剂盒还提供了碘化丙啶染色液，碘化丙啶可以染色坏死细胞或凋亡晚期丧失细胞膜完整
性的细胞，呈现红色荧光。对于坏死细胞，由于细胞膜的完整性已经丧失，Annexin V-FITC 可以
进入到细胞浆内，与位于细胞膜内侧的磷酯酰*结合，从而也使坏死细胞呈现绿色荧光。因
此将 Annexin V 与 PI 匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。
二、试剂盒组成：
试剂 试用装 5T 20T 50T 储存条件
Annexin V-FITC 25μl 100μl 250μl 4℃避光保存
结合液 2.5 ml 10 ml 25 ml 4℃保存
碘化丙啶 （PI） 25μl 100μl 250μl 4℃避光保存
三、试剂盒以外自备仪器和试剂
流式细胞仪或荧光显微镜、低速离心机、移液器、1.5ml 离心管、载玻片、盖玻片、PBS、不
含 EDTA 的*消化液
四、保存条件：
4℃保存，Annexin V-FITC和碘化丙啶染色液需避光保存，一年有效。为长期保存，可以把
Annexin V-FITC和碘化丙啶染色液适当分装后-20℃保存，Annexin V-FITC结合液可以直接-20℃

五、注意事项：
1、如果有细菌或真菌污染，会严重影响检测效果。
2、染色后宜尽快检测，时间过长可能会导致凋亡或坏死细胞的数量增加。
3、荧光物质均易发生淬灭，在进行荧光观察时，尽量缩短观察时间，同时在操作和存放过程中也
尽量注意避光保存。
4、需自备PBS。
5、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
6、本试剂盒适用于检测活细胞，流式细胞仪检测时，细胞数量不以应低于1×105，，不适用于检测
组织样本。
7、因检测细胞的类型、凋亡诱导剂种类、使用的检测仪器不同，因而流式检测的荧光补偿也不同，
因此建议每次检测均需使用未经凋亡诱导处理的细胞作为对照，进行荧光补偿的调节。
8、用流式细胞仪检测，激发波长 Ex=488 nm; 发射波长 Em=530 nm。Annexin V-FITC 的绿色荧光
通过 FITC 通道（FL1）检测；PI 红色荧光通过 PI 通道（FL2 或 FL3）检测，建议使用 FL3。荧
光补偿调节：使用未经凋亡诱导处理的正常细胞，作为对照进行荧光补偿调节去除光谱重叠和
设定十字门的位置。

六、操作规程
1、对于悬浮细胞：
A、在进行完细胞凋亡刺激后，1000g (约1000～2000rpm) 离心5分钟，弃上清，收集细胞，用
PBS轻轻重悬细胞并计数。（注意：PBS重悬不能省略，PBS重悬的过程同时也起到了洗涤细
胞的作用，可以保证后续Annexin V-FITC的结合。）
B、取1～5×105
重悬的细胞，1000g离心5分钟，弃上清，加入500μl 结合液轻轻重悬细胞。
C、加入5μl Annexin V-FITC，轻轻混匀；再加入5μl碘化丙啶，轻轻混匀。
D、室温(20～25℃)避光孵育10分钟。可以使用铝箔进行避光。
E、随即进行流式细胞仪检测，Annexin V-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。如果用于荧光显
微镜下检测，滴一滴上述染色后的细胞悬液于载玻片上，并用盖玻片盖上细胞即可检测。

2、对于贴壁细胞：
A、把细胞培养液吸出至一合适离心管内，PBS洗涤贴壁细胞一次，用*细胞消化液(不
用含有EDTA)消化细胞。（注：*消化时间不易过长，否则容易引起假阳性）
B、细胞消化下来后，加入步骤2A中收集的细胞培养液，稍混匀，转移到离心管内，1000g离心
5分钟，弃上清，收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞并计数。。
C、取1～5×105
重悬的细胞，1000g离心5分钟，弃上清，加入500μl结合液轻轻重悬细胞D、加入5μl Annexin V-FITC，轻轻混匀；再加入5μl碘化丙啶，轻轻混匀。
E、室温(20～25℃)避光孵育10分钟。可以使用铝箔进行避光。
F、随即进行流式细胞仪检测，Annexin V-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。如果用于荧光显
微镜下检测，滴一滴上述染色后的细胞悬液于载玻片上，并用盖玻片盖上细胞即可检测。
3、对于贴壁细胞的原位荧光显微镜检测：
[注]：本方法的优点是可以原位观察细胞凋亡，缺点是部分凋亡由于不贴壁而检测不到。
A、(选做)如果条件许可，把细胞培养于24孔板、48孔板或96孔板内；或将细胞于盖玻片上生
长，用适当的凋亡诱导剂诱导细胞凋亡，并设立阴性对照组。
B、吸除细胞培养液，加入PBS洗涤两次；或将盖玻片用PBS洗涤两次。
C、在500μl的结合液中加入5μl Annexin V-FITC， 5μl碘化丙啶，轻轻混匀。
D、将上述溶液滴加于培养板孔中，或滴加于盖玻片表面，使长有细胞的盖玻片表面均匀覆盖。
E、室温(20～25℃)避光孵育10分钟
F、随即在荧光显微镜下观察，Annexin V-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。