本试剂盒仅供研究使用。 
1 使用目的：：：： 
本试剂盒用于组织、饲料、牛奶、血清和尿样中安定残留的定量检测。 
2 实验原理 
本试剂盒采用竞争 ELISA 方法，在微孔板包被有安定偶联抗原，加入安定标准品或样
品，游离安定与微孔条上预包被的安定偶联抗原互相竞争抗安定抗体酶标记物，用 TMB 底
物显色，加入终止液后颜色由蓝色变为黄色，用酶标仪在 450nm 波长下进行检测，吸光值
与样品中安定含量成反比，通过标准曲线计算样品中安定的含量。 
3 试剂盒组成 
3.1 预包被的安定偶联抗原的可拆酶标板：1块（12孔×8条）。 
3.2 安定标准品：6瓶（1ml/瓶），含量分别是：0 ppb，0.1ppb,0.3ppb,0.9ppb,2.7ppb,8.1 ppb 
3.3抗安定抗体酶结合物：1瓶（6ml）。 
3.4显色液A：1瓶（6ml）。 
3.5显色液B：1瓶（6ml）。 
3.6终止液：1瓶（6ml），2M硫酸。 
3.7*：1瓶（10×, 6ml），用于样品稀释用。 
3.8浓缩洗涤液：1瓶（20×，20ml），用于洗板。 
3.9说明书一份。 
4 需要而未提供的材料 
4.1 设备 
4.1.1波长450nm酶标仪。 
4.1.2粉碎机。 
4.1.3量筒。 
4.1.4振荡器。 
4.1.5漏斗。 
4.1.6Whatman 或相当的滤纸。 
4.1.7微量移液器。 
4.2 试剂 
4.2.1去离子水或蒸馏水。 
4.2.2 甲醇。 
5 贮存 
5.1 试剂盒贮存于2~8℃，切勿冷冻 
5.2 未用完的微孔板应该密封干燥保存 
6 注意事项 
6.1 使用试剂盒前请仔细阅读说明书。 
6.2 不要使用过期试剂盒。 
6.3 试剂盒使用前，将试剂恢复至室温（25±2℃），建议至少回温2小时。 
6.4 标准品中含有安定，使用时应特别注意，操作时应带手套。  
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6.5 终止液中含有硫酸，使用时防止灼伤皮肤及腐蚀衣物。 
6.6 不同标准品、样品所用吸头不能混用，否则会影响试验结果。 
6.7 不同批号试剂盒中的试剂不得混用；不同标准品、样品所用吸头不得混用，否则会影响
实验结果。 
6.8 稀释样本时必须用本试剂盒中的*，否则会影响实验结果 
6.9 混合试剂时应避免起泡。 
7 工作液准备 
7.1 安定标准品溶液：0 ppb，0.1ppb,0.3ppb,0.9ppb,2.7ppb,8.1 ppb 
7.2 浓缩洗涤液：用蒸馏水按1:20(1+19)稀释备用 
7.3 *：用蒸馏水按1:10(1+9)稀释备用 
7.3 显色剂：已备用，避免光线直照 
7.4 反应终止液：已备用 
8 样品处理程序（样品在提取过程中，要严格按说明书操作，提取过程中应准确稀释，否则 样品处理程序
会出现结果不准确，样品应当保存在阴凉避光之处及冷藏保存） 
8.1.1 牛奶 
脱脂奶：直接分析。 
全脂奶：13000g离心15分钟，取上清液检测（避免取到乳脂） 
8.1.2 肝脏： （稀释倍数2） 
--称取2g已绞碎的样品到试管中。 
--加入14ml的乙腈，然后均质（用20000rpm均质几分钟）。 
--振荡15分钟，然后2500g离心15分钟。 
--取上清液1ml到另一玻璃管中在40-50℃下蒸干（利用氮气吹干仪或者旋转蒸发器）。 
--加入250μl去离子水并漩涡混合。 
--溶液待测。 
8.1.3 鸡蛋： （稀释倍数2） 
--取2g样品到试管中，加入6mL乙腈。 
--振荡15分钟，然后3000g离心15分钟。 
--取上清液1ml到另一玻璃管中蒸干（40-50℃）。 
--加入500μl去离子水并漩涡混合。 
--溶液待测。 
8.1.4 蜂蜜： (稀释倍数2) 
---取蜂蜜2g，置于离心管中（约15mL），加入4mL水溶解。 
--加入2ml 乙酸乙脂后，振荡均匀。 
--然后3000rpm，离心15分钟。 
--取上清液0.5ml置于萃取管中于水浴60℃下以氮气吹干。 
--加入0.5ml去离子水混合，振荡约10秒钟。 
--取100μl 待测。 
推荐使用的其它样品的前处理方法： 推荐使用的其它样品的前处理方法：：： 
8.2.1 组织样： （稀释倍数1） 
--取3g绞碎样品置入50ml离心管中。 
--加入6ml乙酸乙酯均质。 
--以3000g离心10分钟。 
--取2ml上清液置入10ml塞玻璃管中，于水浴50℃下以氮气吹干。 
--于此玻璃管中加入2ml正己烷，振荡混合。  
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--再加入1ml去离子水，振荡混合约10秒钟，以离心机3,000g离心10分钟。 
--利用吸管吸去包含中间乳化层部分的上层液（正己烷层）； 
--取50μl待测。 
8.2.2 血清血浆： （稀释倍数1） 
--移取1ml血清或血浆至试管中，加2ml乙酸乙酯振荡1分钟。 
--室温3000g离心10分钟。 
--移取1ml上层的乙酸乙酯至另一试管中，用氮气流60 oC水浴中吹干。 
--残留物用0.5ml去离子水溶解。 
--取100ul 待测。 
8.2.3 饲料样品： （稀释倍数4） 
--取1g饲料样品(精细粉碎过的，有代表性的)，放入离心管中。 
--加4ml乙酸乙酯剧烈混合1分钟（用可旋转振荡摇床） 
--室温3000g离心10分钟。 
--移取1ml上层的乙酸乙酯至另一试管中，60 oC氮气流下蒸干。 
--用1ml异辛烷/氯仿混合物(2:3混合)溶解干燥的残留物。 
--加入1ml去离子水强烈振荡1分钟。 
--室温3000g离心10分钟。 
--取100μl上层水相待测。 
8.2.4 尿液： （快速处理方法） 
--尿液不用处理，直接测定。（如果尿液浑浊，一定要过滤或离心） 
9 酶免分析步骤 
9.1 实验须知 
9.1.1 实验开始前请将所有试剂于盒外充分恢复至室温（25±2℃），时间约2小时。回温至室
温（25±2℃）后再取出微孔条，多余的微孔条重新密封立即于2~8℃干燥保存 
注：一定保证回温充分，否则影响检测的度和准确度。 
9.1.2 使用后请立即将试剂放回2~8℃保存 
9.1.3 请不要改变分析程序 
9.1.4 请使用的微量移液器 
9.1.5 操作一旦开始，请不要中断任何程序 
9.1.6 ELISA结果的可重复性极大程度的取决于操作程序，请严格按照要求操作 
9.1.7 为避免交叉污染，每个标准品和样品均应使用不同的吸头加样 
9.1.8 加样时请勿让吸头接触微孔中的溶液或内表面 
9.2 分析步骤 
9.2.1 预*行编号，标记B0、标准品和样品的位置，推荐进行双孔检测 
9.2.2 取所需数量的微孔（微孔条可拆），将多余板条重新密封并立即放回2~8℃保存 
9.2.3 样品稀释液（10×）、浓缩洗涤液（10×）稀释成工作液(蒸馏水或去离子水稀释) 
9.2.4 在B0孔中加入50μl0.0 ng/ ml标准品溶液 
9.2.5 在各标准孔中加入50μl的标准品溶液 
9.2.6 在各样品孔中加入50μl样品溶液 
9.2.7 在所有孔中加入50μl的抗安定抗体酶结合物 
9.2.8 轻轻晃动反应板几秒钟。 
9.3 37℃温浴30min （温浴过程中不时轻拍反应板，可以减少双孔误差） 
9.3.1 甩掉孔中液体，用洗液洗涤微孔板5次，zui后一次应在吸水纸上拍打以*除去孔中液
体。  
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9.4 反应 
9.4.1 洗涤程序完成后，立即用微量移液器在每个微孔中先加入50μl显色液A，再加 50μl显
色液B；轻微晃动反应板使之*混匀 
9.4.2 37℃温浴10min 
9.4.3 每孔中加入50μl终止液，混匀 
9.4.4 在450nm下检测吸光度，结果在5min内读取。 
10 结果计算 
10.1定量分析 
10.1.1所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值（B）除以*个标准（0标准）
的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸光度值。 
B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值 
B0—0μg/L标准溶液的平均吸光度值 
10.1.2以安定浓度的对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。根据样品百分吸
光度值，可从曲线上得到对应点的横坐标，即为安定浓度的对数值，求得反对数即为测定液
中安定浓度C（ppb） 
10.1.3由于样品经过了预先稀释，因此根据标准曲线所得出的样品浓度一定要再乘以其稀释
倍数。 
10.2 半定量测定 
10.1.1目测半定量测定：首先选择一个适当的标准液与样品同运行，根据样品与标准品吸光
度值的高低比较，判断样品浓度值是小于还是大于标准值。 
10.1.2仪器半定量测定：首先选择一个适当的标准液与样品同运行，根据样品与标准品颜色
深浅比较，判断样品浓度值是小于还是大于标准值。 
11 特异性 
物质 交叉反应 
安定 100% 
 
12 试剂盒参数 
本试剂盒检测下限为0.05ppb 
B0吸光度*值应大于1.0 
试剂盒吸光度板内误差小于8％，板间误差小于15％。 
用本说明书提供的组织样本提取方法回收率大于80％。 
13 
试剂盒提供的标准曲线范围为0.1ppb~8.1ppb。 
 
 
14 分析限制 
本试剂盒检测为阳性的样品应该用另一种方法如HPLC或GC/MS加以确证。