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细胞培养条件影响GFP的光稳定性

时间:2015-5-19阅读:241
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光稳定性(photostability)是荧光蛋白的一个重要特征。不过,它并不是一成不变的。研究人员发现,活细胞中绿色荧光蛋白(GFP)的光稳定性受到培养基组分以及细胞生长条件的影响。

由于荧光蛋白具有自发发出荧光的*能力,它们被广泛应用于追踪基因表达、标记感兴趣的蛋白质,和实时监控细胞的生理状况。野生型的GFP来自水母,尽管它发出绚丽的荧光,但在高等动物的细胞中,它的光谱并非*,且在37oC不能正确折叠。不过,这些问题在不久之后就通过突变解决了。增强型GFPEGFP)可能就是人们zui熟知的突变体。

当然,除了荧光亮度,光稳定性也是荧光蛋白的一个重要特征。延时显微镜、3D图像重建和单分子检测等应用会受到光稳定性的影响。为了提高荧光蛋白的光稳定性,人们广泛采用了定点突变和随机诱变。zui近,研究人员也建议对成像培养基的组分进行优化。这是因为,GFP参与了光驱动的氧化还原反应,导致绿色到红色的光转换。因此,培养基组分对这些反应的抑制可增强绿色通道的光稳定性。

于是,研究人员测定细胞生长条件和培养基组分对EGFP光稳定性的影响,以便找出EGFP成像的*条件。他们利用EGFP-C1载体转染了HEK293T细胞,并在转染48小时后用LeicaAF6000 LX荧光显微镜成像。在成像之前,细胞培养基被更换成新鲜的DMEM或其他待研究的培养基(Ham's F12RPMI 1640)。

他们发现,所有培养基都不影响EGFP在细胞中的初始亮度。在DMEMRPMI 1640中表达的EGFP光稳定性几乎相同,不过芸香叶苷的添加使光稳定性增加了数倍。相比之下,Ham's F12培养基则带来了非常高的EGFP光稳定性(DMEM6-7倍),且几乎不受芸香叶苷的影响。

DMEM相比,F12培养基的核黄素和吡哆醇的浓度降低,而这些维生素会明显降低EGFP的光稳定性。同时,氧化还原活性化合物,如氰钴胺(微生物B12)、*、次黄嘌呤和胸苷的浓度增高。研究人员进一步发现,这些化合物单独添加到DMEM培养基中,对EGFP的光漂白没有任何影响,不过它们的组合能使光稳定性提高2倍。

此外,他们还发现,EGFP的光漂白速率在很大程度上取决于细胞的生长条件,如细胞密度和血清的浓度。在2% FBS下检测到zui低的光稳定性,而20% FBS下zui高。对于DMEM培养基,这两者的差异在2.5-3倍。

基于这些研究,作者认为,荧光蛋白光稳定性的比较应尽可能在相同的条件下平行开展,而将不同论文中的数值拿来比较是非常不准确的。

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