一.实验目的
酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA)是在免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术,ELISA过程包括抗原(抗体)吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体(抗原), 再加相应酶标记抗体(抗原),天生抗原(抗体)--待测抗体(抗原)--酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应天生有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体(抗原)的量。待测抗体(抗原)的定量与有色产天生正比。
二.实验原理
用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物酶，碱性磷酸酯酶，β-D-半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，AchE，6-磷酸葡萄糖脱氧酶等。常用于ELISA法的酶有辣根过氧化物酶，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。由于酶摧化的是氧化还原反应，在呈色后须立即测定，否则空气中的氧化作用使颜色加深，无法正确地定量。
辣根过氧化物酶(HRP)是一种糖蛋白，每个分子含有一个氯化血红素(protonhemin)区作辅基。酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示。氯化血红素辅基的大吸收峰是403nm，HRP酶蛋白的大吸收峰是275nm，所以酶的浓度和纯度计算式是(已知HRP的A(1cm 403nm 1%)=25，式中1%指HRP百分浓度为100ml含酶蛋白1g，即10mg/ml，所以，酶浓度以 mg/ml 计算是HRP的A(1cm 403nm mg/ml=2.5)HRP纯度(RZ)=A403nm/A275nm纯度RZ(Reinheit Zahl)值越大说明酶内所含杂质越少。高纯度HRP的RZ值在3.0左右，
ELISA的主要常用类型及步骤
1. 间接法测抗体
间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体(二抗)以检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下：
1)将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原，洗涤除去未结合的抗原及杂质。
2)加稀释的样本，保温反应。样本中的特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体，样本中的其他成份在洗涤过程中被洗去。
3)加酶标抗抗体。固相免疫复合物中的抗体与酶标抗抗体结合，从而间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量与样本中受检抗体的量正相关。
4)加底物显色。
2.双抗体夹心法测抗原
双抗体夹心法是检测抗原的方法，操作步骤如下：
1)将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。
2)加受检样本，保温反应。样本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。
3)加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。*洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与样本中受检抗原的量相关。
4)加底物显色。
3.双抗原夹心法测抗体
反应原理和模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体
4.竞争法测抗原
小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，后的显色也愈浅。小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。
