ELISA试剂盒以其快速、准确、安全、简便的特点而成为定量测定生物体内微量有机物的理想方法.为了建立一套快速、有效、方便并能定量测定大鼠MT抗小鼠ELISA试剂盒抗血清法,为动物科学中的研究和应用提供MT的定量测定技术.
1.大鼠MT抗小鼠ELISA试剂盒抗血清的制备:用戊二醛法将纯品Zn-MT与载体蛋白(BSA)偶联后,作为人工抗原,对大鼠皮下注射.免疫时抗原中MT量分别为6ug/只、12ug/只、24ug/只、48ug/只、96ug/只;加强免疫时所用抗原量依次加倍.前3次免疫时采用的是弗氏*佐剂乳化,后3次免疫采用弗氏不*佐剂乳化. 两批大鼠加强免疫的时间隔分别为12日和16日.用免疫双扩散方法测定抗血清效价.得出以下结论:当免疫抗原中MT的量为12-24ug/只,每次加强免疫时抗原量加倍,加强免疫间隔时间为10日时,其免疫效果较佳,可使大部分大鼠抗血清效价达到1:16以上.
2.抗体的纯化及鉴定:将效价达到1:16以上的大鼠MT抗小鼠ELISA试剂盒抗血清血清用饱和硫酸铵盐析法浓缩出γ-球蛋白,然后用DEAE-Sephadex A50层析柱分离提纯IgG.实验中发现洗脱液pH值为7.4时洗脱*峰即为纯化的IgG,用不连续缓冲系统聚丙烯酰胺凝胶浓度梯度电泳鉴定层析洗脱下的IgG达到电泳纯.对纯化后的IgG进行辣根过氧化物酶标记,用直接ELISA鉴定其为MT的特异性抗体.
3.ELISA试剂盒的建立:运用固相抗原间接非竞争型ELISA试剂盒和固相抗原间接竞争型ELISA试剂盒检测猪体组织中部分样品MT的含量,结果表明:用间接非竞争型ELISA试剂盒测定样品时其结果不够稳定,同一样品所对应的0D值相差较大,此方法仅适合于样品中MT定性检测;采用间接竞争型ELISA测定样品,OD值比较稳定.用方阵滴定法确定了间接竞争型ELISA的各项具体条件:抗原*包被浓度为6.25ug/ml,一抗(小鼠抗大鼠)使用适宜浓度为50ug/ml,酶标抗体(山羊抗大鼠)的使用浓度为1/8000倍,反应时间为3hr.用标准MT,采用间接竞争型ELISA试剂盒方法拟合的标准曲线回归方程为:y=105×2(22.32880-0.39583x),相关系数为:R=0.9592.该方法的灵敏度为4.1ng/ml,批间和批内变异系数为9.9760％-14.3858％,在实际应用中有较好的稳定性.
