ELISA显色液TMB的增加适度
ELISA显色液TMB的增加适度?
自己用用夹心放测大鼠血清中IgE含量，从包板子到显色读数都是自己做。
大体步骤如下：
用Rat anti-mouse IgE包被ELISA板，每孔100ul，4度12-16小鼠
洗板封闭，封闭液150ul
弃掉封闭液，加入稀释的待检血清80ul，4度过
洗板，加入Biotin- Rat anti-mouse IgE 75ul, 室温2小时
洗板，加入avidin-HRP 72ul，室温40分钟
洗板，加TMB显色液60ul，适时加强酸90ul终止。
自己的问题：
zui开始时，包被液、封闭液、血清、Biotin连的抗体、avidin-HRP及TMB都是加100ul，后来知道了ELISA的原理了之后，就做了上边的调整，自己调整的原因是封闭液是结合板子上非特异结合的位点，所以可以多加一些，后边越加越少是觉得有时排枪加样不小心会带有气泡，如果都是一样的体积的话，气泡有可能影响zui顶层液面和板壁上抗原的结合（但每回都会放在摇床上孵育，也观察过气泡基本会自行消失）。自己每次加TMB显色，总是观察到刚加进去不一会出现蓝色出现的很明显，过一会变化就不太大了，我看各个孔之间差异还很明显就加强酸终止了（也就5-6分钟），读板发现标准曲线还可以，R2可以到0.99；问题是TMB显色液有一定的显色能力吗？自己加的少的话是不会影响zui后的吸光值？（原来加100ul的时候，吸光值可以到2.2-2.3，但是吸光值再也不会高了），现在往往zui大的样本能到1.6-1.7，看别人都*显色10-30分钟，是自己的显色时间不够吗？
此外，zui后终止时是否应该加入等量的终止液，否则液体被稀释了就不能反映原始的吸光度值了？
